《Advanced Science》：Selective Targeting of Tip Endothelial Cells as a Therapeutic Strategy for Tumor Angiogenesis
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本研究聚焦肿瘤病理新生血管形成的关键启动者——尖端内皮细胞（TipEC），鉴定出Doppel（PRND）蛋白作为其特异性的可成药靶点。研究发现，Doppel通过空间调控VEGFR2/Dll4/Src通路，选择性增强TipEC功能，而靶向其保守WQF基序的单抗（如4D6）能有效抑制肿瘤生长。这为克服传统抗血管治疗（如抗VEGFR2）的毒性及耐药性，实现精准干预病理血管生成提供了新策略。
引言：挑战与靶点
新生血管形成是肿瘤生长与转移的关键。在这一过程中，尖端内皮细胞（TipEC）如同血管新生的“探路先锋”，负责引导方向与迁移，而柄部内皮细胞（StalkEC）则负责增殖形成管腔结构。TipEC与StalkEC之间的动态平衡（Tip-Stalk specification）精密调控着血管生成。然而，由于TipEC身份的高度可塑性，长期以来缺乏其特异性分子标记，使得精准靶向TipEC成为抗血管治疗领域的巨大挑战。本研究旨在探索这一难题，并聚焦于一个名为Doppel（由PRND基因编码）的蛋白。Doppel是朊蛋白（PrP）的同源物，既往研究提示其与多种肿瘤类型的异常血管生成有关，且在生理性血管生成中几乎不表达，这使其成为一个极具潜力的、病理特异性的治疗靶点。
结果发现
1. Doppel特异性标记肿瘤中的尖端内皮细胞亚群
通过对肿瘤内皮细胞的单细胞RNA测序数据分析，研究人员将内皮细胞分为动脉、静脉、尖端样、柄部样和过渡型等多个亚型。密度图谱和提琴图分析均显示，PRND基因的表达在尖端样细胞（TipEC）中特异性富集。火山图分析进一步证实，PRND是TipEC相较于StalkEC最显著上调的基因之一，这从转录组层面确立了Doppel与TipEC身份的强关联性。
2. Doppel在体外诱导尖端细胞表型并激活VEGFR2信号通路
功能实验表明，用重组Doppel蛋白处理正常内皮细胞（如人脐静脉内皮细胞HUVEC和人真皮微血管内皮细胞HDMEC），能够显著增加尖端细胞标志物CD34+、Dll4+以及CD34+Dll4+CXCR4+细胞亚群的比例，并增强VEGF诱导的内皮细胞球出芽。机制上，Doppel作为VEGFR2的共受体，能直接与其相互作用并增强其磷酸化，甚至在低浓度VEGF下也能维持VEGFR2的激活状态，降低了VEGF介导的信号传导阈值。对PRND阳性和阴性内皮细胞的差异基因分析及通路富集分析均确认，Doppel表达与VEGF/VEGFR2信号通路强烈相关。
3. Doppel促进TipEC的丝状伪足延伸和运动性
在TipEC群体内进一步分析发现，PRND阳性细胞与阴性细胞在转录组上存在显著差异。富集到的通路多与肌动蛋白丝组织、趋化性和细胞外基质重塑相关，提示Doppel在促进细胞骨架重组和定向迁移中起作用。形态学观察证实，过表达Doppel的内皮细胞表现出更长的形态和显著的丝状伪足样突起。重要的是，在Doppel表达的细胞中，VEGFR2从广泛的胞浆分布重新定位于细胞的“前沿”或引导边缘，这被认为有助于增强细胞对血管生成梯度信号的响应能力。
4. Doppel通过VEGFR2-Dll4信号通路调控出芽血管中的尖端-柄部细胞动力学
研究人员利用一种生物工程平台，制造出交替的VEGF富集区和贫乏区条纹，以模拟体内梯度。研究发现，稳定表达Doppel的细胞（HuDpl）能更有效地向VEGF富集区定向迁移，并且其VEGFR2信号在VEGF富集区显著富集，显示出极化分布。在三维出芽模型中，HuDpl细胞球产生了更长、尖端细胞数量更多的出芽，并显示出更高的Dll4表达。这表明Doppel通过增强VEGFR2在前沿的极化信号，并上调Dll4，可能异常地调控了VEGFR2–Dll4–Notch轴，从而稳定了TipEC的身份，并可能破坏生理性的尖端-柄部细胞平衡。
5. Doppel基因敲除可减少肿瘤中的TipEC数量，但不影响StalkEC
为了评估Doppel缺失的体内影响，研究人员培育了Doppel基因敲除小鼠。在多种肿瘤模型（如B16-F10黑色素瘤）中，与野生型小鼠相比，Doppel敲除小鼠的肿瘤生长显著减缓。流式细胞术分析显示，敲除小鼠肿瘤中TipEC（CD31+CXCR4+）的比例显著降低，而StalkEC（CD31+SELP+）的数量未受影响。同时，肿瘤血管密度也明显降低。RNA测序进一步揭示，Doppel缺失选择性地下调了与尖端和未成熟内皮细胞相关的基因，而上调了过渡和柄部细胞标记基因。这表明Doppel的缺失会使内皮细胞的转录程序从尖端细胞表型转向，从而抑制出芽血管生成。
6. 靶向Doppel保守表位的首创新药单克隆抗体的开发
基于上述发现，研究团队开发了多株抗Doppel的单克隆抗体（mAb）。其中，抗体4D6和5C7在体内外实验中均显示出抑制血管生成和肿瘤生长的潜力，尤以4D6效果更为显著。通过表位作图发现，4D6靶向Doppel蛋白α1结构域末端一个高度保守的YWQFPD基序（核心为WQF），该区域在物种间高度保守。而5C7则结合于N端尾部一个柔性区域。结构分析表明，4D6所靶向的表位位于一个表面可及且结构关键的区域，这可能是其疗效更优的原因。在HCT116人结肠癌等多种模型中，4D6治疗能剂量依赖性地减小肿瘤体积和重量，并降低肿瘤微血管密度。
7. 选择性清除Doppel阳性TipEC是一种有效的治疗策略
研究人员将靶向Doppel的抗体（4D6）与靶向VEGFR2和Dll4的抗体进行了疗效与机制比较。三者均能延缓肿瘤生长，但作用模式截然不同：抗VEGFR2同时减少了TipEC和StalkEC的数量；抗Dll4则因阻断Notch介导的侧向抑制，导致TipEC数量异常增多（产生无序的非功能血管）；而抗Doppel（4D6）选择性地减少了VEGFR2+的TipEC数量，却不影响StalkEC。这使内皮细胞群从以TipEC为主导转向以StalkEC为主导。这种选择性清除TipEC的策略，在4T1原位乳腺癌等难治性模型中，展现出不逊于甚至优于抗VEGFR2治疗的抗肿瘤效果，且对正常组织（如肝脏）血管无显著影响，显示出良好的治疗选择性。
讨论与意义
本研究系统性地阐明了Doppel作为TipEC特异性、可成药靶点的生物学功能与治疗潜力。Doppel通过增强VEGFR2信号、促进细胞骨架重塑和定向迁移、并可能干扰Dll4-Notch平衡，在病理血管生成中扮演了“守门人”的关键角色。其表达的高度选择性（主要限于病理性环境）为实现精准治疗奠定了基础。与传统的、广泛作用于所有内皮细胞的抗VEGFR2疗法相比，选择性靶向Doppel阳性TipEC的策略有望在保持抗肿瘤疗效的同时，规避对正常血管的毒副作用，为解决当前抗血管生成疗法面临的耐药性和毒性难题提供了新的思路和工具。因此，Doppel及其靶向抗体（如4D6）为开发下一代更安全、更精准的抗肿瘤血管生成疗法开辟了崭新途径。
