《Advanced Science》：DSG2+ Cancer Stem Cells Co-Located With FAP+ Myofibroblasts in the Tumor Boundary That Determines the Efficacy of Immunotherapy in Non-Small Cell Lung Cancer
编辑推荐：
本研究通过整合单细胞RNA测序与空间转录组学，首次系统性地鉴定了非小细胞肺癌（NSCLC）中的癌症干细胞（CSC）特征基因，并锁定DSG2为核心标记。研究发现，DSG2高表达与化疗耐药相关，并能预测EGFR-TKI治疗反应。空间定位揭示DSG2+CSC在肿瘤边界富集，并与FAP+myCAF共定位，形成支持性微环境（niche）。功能实验证实myCAF通过基质金属蛋白酶（MMP）依赖性旁分泌信号增强CSC特性，该共定位结构对免疫治疗效果具有负面影响。本文为理解NSCLC治疗抵抗的微环境机制提供了全新视角，并指出DSG2与FAP可作为潜在治疗靶点与预测标志物。
引言：肺癌治疗抵抗与肿瘤微环境之谜
肺癌是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占绝大多数。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但耐药性仍然是实现持久疗效的主要障碍。越来越多的证据表明，癌症干细胞（CSC）是驱动肿瘤发生、进展、复发和治疗抵抗的关键。然而，CSC在NSCLC中的转录程序和空间组织仍不完全清楚。肿瘤微环境（TME），特别是其中的基质细胞，在维持CSC特性和促进耐药中扮演着关键角色。本研究旨在通过整合单细胞RNA测序与空间转录组学，系统定义NSCLC中的CSC表型，并解析其与肿瘤微环境的相互作用。
结果1：利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定CSC特征
为系统性鉴定CSC，研究分析了来自42个NSCLC肿瘤的单细胞RNA测序数据。由于单细胞数据的稀疏性和异质性，研究采用Metacell算法将50,275个恶性细胞聚合成498个转录组相似的元细胞（metacell），以获得更稳健的基因表达模式。随后，对元细胞构建基因共表达网络，并通过与CytoTRACE（一种评估细胞分化状态的算法）评分关联，鉴定出与干细胞特性最相关的基因模块——青绿色模块。将该模块中的基因与恶性细胞标记基因取交集，最终获得一个包含127个基因的CSC特征集。该特征集包含EPCAM、EGFR等已知的干细胞相关基因。其中，桥粒芯糖蛋白2（DSG2）脱颖而出，成为一个主导性的标记基因。在多个独立NSCLC单细胞数据集中的验证表明，该CSC特征评分与CytoTRACE评分高度一致，证实了其可靠性。
结果2：DSG2在化疗和EGFR-TKI治疗中的负面作用
研究进一步在多个临床队列中评估了CSC特征和DSG2的预后与预测价值。分析显示，在化疗和EGFR-TKI治疗的NSCLC患者中，更高的CSC评分或DSG2表达与更短的总生存期（OS）显著相关。特别值得注意的是，在BPI-7711临床试验的前瞻性队列中，研究者通过质谱法量化了患者基线血浆中的521种蛋白质。其中，DSG2是CSC特征中包含的11种蛋白质之一，并且在非应答者（NR）中的表达水平显著高于应答者（R）。生存分析显示，循环血液中高水平的DSG2与更差的临床结局强烈相关。这些结果共同提示，DSG2不仅是CSC的关键标记，还具有作为预测化疗和靶向治疗反应的血清生物标志物的潜力。
结果3：空间转录组学揭示DSG2+ CSC与FAP+ myCAF在肿瘤边界共定位
为了揭示CSC在肿瘤组织中的空间分布，研究对6例NSCLC患者的肿瘤组织切片进行了空间转录组学测序。通过inferCNV分析准确区分恶性细胞后，研究发现DSG2的表达主要富集于肿瘤区域，并且在肿瘤边界的表达水平最高，这表明DSG2+ CSC具有侵袭性特征。随后，利用CARD软件进行细胞类型反卷积分析，推断出每个空间点位上六种主要细胞类型（上皮细胞、髓系细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞）的组成。结果显示，成纤维细胞是浸润肿瘤区域的主要细胞类型。进一步分析癌症相关成纤维细胞（CAF）的亚型发现，肌成纤维细胞（myCAF）亚型在肿瘤区域内特异性浸润，而其他CAF亚型（如iCAF、apCAF等）更多分布于邻近的正常组织中。在myCAF的典型标记物中，成纤维细胞激活蛋白（FAP）与DSG2的表达显示出最强的空间相关性。绝大多数同时表达DSG2和FAP的位点位于肿瘤边界，形成了DSG2+ CSC与FAP+ myCAF的共定位模式。这一发现通过多重免疫荧光在蛋白水平上得到了验证。
结果4：DSG2+ CSC和FAP+ myCAF在免疫治疗中的负面作用
研究分析了单细胞数据中CAF的亚型特征，发现FAP+ myCAF高表达基质金属蛋白酶MMP9和MMP12，并富集于上皮-间质转化（EMT）、血管生成等通路，同时抑制补体激活等免疫相关通路，提示其可能促进EMT并抑制免疫反应。临床数据分析表明，与癌旁组织相比，肿瘤样本中FAP+ myCAF的浸润显著增加，且其高水平与更晚的NSCLC分期和更差的OS相关。更重要的是，在ORIENT-3临床试验的免疫治疗队列中分析发现，非应答者（NR）的肿瘤组织中具有更高的FAP和DSG2表达水平。生存分析证实，高FAP或高DSG2表达与免疫治疗患者更差的疗效显著相关。这揭示了CSC-myCAF共定位结构在介导免疫治疗抵抗中的潜在作用。
结果5：DSG2+ CSC与FAP+ myCAF之间的细胞间通讯
鉴于DSG2+ CSC与FAP+ myCAF在肿瘤边界的共定位，研究者深入分析了二者之间的细胞间通讯。在单细胞水平，MDK（中期因子）和SPP1（骨桥蛋白）信号通路被识别为这两种细胞类型之间通讯的关键介质。特别值得注意的是，MDK信号通路显示出最高的通讯强度。分析表明，来自FAP+ myCAF的MDK可以激活DSG2+ CSC上的核仁蛋白（NCL）受体。NCL是一种穿梭于细胞表面与细胞核之间的蛋白质，为细胞外信号调控核内事件提供了机制。多重免疫荧光结果在蛋白水平证实了MDK-NCL这一配体-受体对在肿瘤边界区域的特异性相互作用。
结果6：DSG2是维持NSCLC细胞CSC特性和增殖能力所必需的功能性蛋白
为了明确DSG2在NSCLC中的功能，研究者在A549和HCC827细胞系中敲低了DSG2表达。结果显示，DSG2敲低导致干细胞相关转录因子（OCT4、SOX2、NANOG、MYC）和经典CSC标记物（CD44、ALDH1A1、CD133）的表达显著下调。在功能上，DSG2敲低严重损害了CSC相关特性：肿瘤球形成能力、单细胞克隆形成能力和细胞侵袭能力均显著下降。细胞活力实验进一步表明，DSG2敲低也降低了细胞的增殖能力。这些数据证明，DSG2在功能上是维持NSCLC细胞CSC相关分子程序、自我更新能力、侵袭性和增殖潜力所必需的。
结果7：FAP+ myCAF通过MMP依赖性旁分泌信号增强DSG2高肿瘤细胞的CSC特性
为了功能性验证CSC与成纤维细胞的相互作用，研究者通过流式细胞分选术（FACS）从A549和HCC827细胞中分离出DSG2高和DSG2低的肿瘤细胞群体。同时，将成纤维细胞诱导分化为FAP+ myCAF。通过Transwell共培养实验发现，与FAP+ myCAF共培养可显著上调DSG2高肿瘤细胞中干细胞相关转录因子和CSC标记物的表达，并增强其克隆形成、肿瘤球形成和侵袭能力。而使用广谱基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂GM6001处理，可以显著减弱myCAF诱导的这些CSC表型增强效应。这表明FAP+ myCAF通过MMP依赖性的旁分泌机制，主动促进了DSG2高肿瘤细胞的CSC特性和生长，超越了单纯的空间共定位，构成了功能性的CSC-myCAF相互作用。高肿瘤细胞的CSC特性。(A) DSG2高/低细胞分选策略。(D) 共培养条件下DSG2高细胞中干细胞标志物的表达变化。(E, F) 共培养对克隆形成、肿瘤球形成和侵袭能力的影响及定量。">
讨论与展望
本研究系统描绘了NSCLC中一个空间组织化的DSG2+ CSC–myCAF生态位（niche），该结构是导致治疗抵抗（包括化疗、靶向治疗和免疫治疗）的关键因素。DSG2不应被视为一个静态的、排他性的CSC标记，而是反映了一种可塑的干细胞样状态。尽管靶向DSG2可能存在挑战，但利用抗体偶联药物（ADC）、逻辑门控设计等策略可能提供治疗窗口。同时，靶向FAP+ myCAF或破坏MDK-NCL信号通路，为联合治疗提供了新思路。本研究的主要局限在于部分关联分析基于回顾性队列，需要前瞻性验证，且CSC-myCAF相互作用的后果有待更多实验证实。总而言之，这项工作为理解NSCLC治疗抵抗的微环境机制提供了一个全新的空间和功能框架，并指明了DSG2和FAP作为预测性生物标志物和潜在治疗靶点的价值。
