《Advanced Science》：Antagonistic Ubiquitin Switching by USP7 and RNF40 Orchestrates KDM6A Homeostasis to License Coronavirus Susceptibility
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这篇研究性论文揭示了一个由泛素化精细调控的宿主-病毒互作新机制。研究团队发现去泛素化酶USP7通过稳定组蛋白去甲基化酶KDM6A，上调多种冠状病毒受体（ACE2、DPP4、Ceacam1）表达，从而促进病毒感染；而E3泛素连接酶RNF40则通过K6/K11位点泛素化介导KDM6A的自噬性降解，起到限制病毒感染的作用。该研究将USP7确立为一种广谱的抗冠状病毒宿主靶点，其小分子抑制剂在小鼠模型中展现出良好的耐受性和保护效果，为针对当前及未来冠状病毒威胁提供了新的宿主导向治疗策略。
引言
2019冠状病毒病（COVID-19）大流行持续威胁全球公共卫生。随着SARS-CoV-2的不断演变，现有授权疫苗、单克隆抗体及抗病毒药物的效力有所下降，这凸显了开发针对当前及新兴冠状病毒的广谱抗病毒策略的必要性。宿主导向疗法因其更高的耐药遗传屏障和应对未来冠状病毒的潜力而备受关注。冠状病毒感染始于病毒刺突糖蛋白与特定宿主受体的结合，这是病毒生命周期中的关键第一步。主要的受体包括介导SARS-CoV、SARS-CoV-2和HCoV-NL63感染的血管紧张素转换酶2 (ACE2)，介导MERS-CoV感染的二肽基肽酶4 (DPP4)，以及介导小鼠肝炎病毒 (MHV) 感染的癌胚抗原相关细胞黏附分子1 (Ceacam1) 等。越来越多的证据表明，调控这些受体的表达可能是预防冠状病毒感染的可行策略。
研究表明，表观遗传调控因子如组蛋白去甲基化酶KDM6A（也称UTX），通过调控染色质可及性和增强子激活，在调节冠状病毒受体表达中扮演核心角色。KDM6A可与赖氨酸甲基转移酶KMT2D和乙酰转移酶p300形成复合物，促进受体基因位点的染色质开放。然而，调控KDM6A蛋白质稳态的上游机制尚不清楚。蛋白质稳态对维持正常生理功能至关重要，而泛素化是调节蛋白质稳定性的最重要翻译后修饰机制之一。去泛素化酶（DUB）通过去除泛素分子来微调蛋白质稳定性和功能。其中，泛素特异性蛋白酶7 (USP7) 是一种广泛研究的半胱氨酸蛋白酶，在细胞调控中扮演多种角色，并与癌症、炎症反应和病毒感染等多种病理过程相关。
本研究旨在揭示一个拮抗性的泛素介导调控环路，该环路动态控制KDM6A的稳定性，从而调控细胞对多种冠状病毒的易感性。
结果
1. USP7是多种高致病性冠状病毒感染所必需的
通过CRISPR-Cas9敲除技术构建USP7基因敲除细胞系，研究团队发现，无论是在猴源细胞（Vero E6）还是人源细胞（Huh7.5）中，失活USP7均能显著抑制SARS-CoV-2及其报告病毒icSARS-CoV-2-mNG的复制和病毒产量。研究进一步将范围扩展至其他高致病性冠状病毒，包括表达SARS-CoV-1刺突蛋白的蝙蝠冠状病毒HKU5（HKU5-SARS1-S）和MERS-CoV。实验结果表明，USP7的缺失同样降低了这些病毒诱导的细胞死亡和病毒复制。通过冠状病毒刺突蛋白假病毒感染实验，研究者证实USP7的失活同样阻断了SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV的假病毒进入细胞。这些结果共同证明，USP7在高致病性冠状病毒感染中扮演着关键的角色。
2. USP7的去泛素化酶活性是调控ACE2和DPP4表达所必需的
为了探究USP7如何调控病毒进入，研究者首先分析了冠状病毒受体的表达。基因敲除USP7后，ACE2和DPP4的mRNA水平以及ACE2的蛋白表达均有所下降。为了确定USP7的去泛素化酶活性是否是其促病毒活性所必需的，研究者在USP7敲除细胞中回补了野生型USP7 (WT) 或其去泛素化酶活性失活的突变体 (C223S)。结果显示，只有回补野生型USP7，而非C223S突变体，才能恢复ACE2和DPP4的表达、SARS-CoV-2的复制、病毒诱导的细胞死亡以及假病毒的进入能力。通过外源性表达人源ACE2和DPP4，可以在USP7敲除细胞中恢复病毒感染和假病毒进入。这些数据证明，USP7以去泛素化酶活性依赖的方式促进高致病性冠状病毒感染，其机制正是通过调控ACE2和DPP4的表达来实现。
3. USP7对KDM6A进行去泛素化并使其稳定
研究者进一步探究了USP7调控病毒受体的上游靶点。基于已知的ACE2和DPP4的表观遗传调控因子，研究者通过免疫共沉淀（Co-IP）实验发现，USP7与KDM6A和染色质重塑复合物BAF的组分SMARCA4存在相互作用，但与转录因子HNF1A和HNF1B无互作。内源性KDM6A也能将USP7拉下。由于USP7失活与KDM6A缺失在抑制冠状病毒感染方面表型相似，研究者推测USP7可能通过靶向KDM6A来发挥作用。
实验证实，过表达野生型USP7，而非C223S突变体，能以剂量依赖的方式稳定KDM6A。相反，基因敲除USP7会降低KDM6A蛋白水平，但不影响其mRNA水平。蛋白酶体抑制剂MG-132处理可以恢复USP7敲除细胞中的KDM6A表达，提示USP7可能调控KDM6A的泛素化介导的蛋白酶体降解。泛素化实验进一步证实，野生型USP7能特异性去除KDM6A上K48连接的多聚泛素链，而C223S突变体则无此功能。此外，研究者发现KDM6A蛋白上的赖氨酸位点K29、K299和K1315（3KR突变体）对其泛素化至关重要，3KR突变体对USP7介导的去泛素化和稳定作用不敏感。
为了确认USP7是否通过KDM6A调控病毒感染，研究者在KDM6A敲除细胞中再次敲除USP7，发现双敲细胞与KDM6A单敲细胞在病毒复制抑制程度上相似，表明USP7的促病毒活性确实通过KDM6A介导。在USP7敲除细胞中回补KDM6A的3KR（泛素化抗性）突变体，而非野生型KDM6A，能够恢复ACE2和DPP4的表达以及假病毒感染。此外，USP7的缺失减少了KDM6A在ACE2基因启动子和增强子区域的富集，同时也降低了这些区域的活跃增强子标记H3K27ac的水平。综上所述，USP7通过去泛素化并稳定KDM6A来促进高致病性冠状病毒感染，而KDM6A的正常招募和功能对于病毒受体基因位点的调控至关重要。
4. RNF40泛素化并降解KDM6A以限制病毒感染
为了解KDM6A稳态的另一面，研究者着手寻找介导其降解的E3泛素连接酶。通过分析KDM6A互作蛋白组数据，筛选出三个候选E3连接酶RNF40、HUWE1和KCMF1。互作实验确认KDM6A与RNF40和KCMF1存在关联，内源性RNF40也能将KDM6A拉下。功能实验表明，过表达RNF40（而非其伴侣RNF20或KCMF1）能以剂量依赖的方式降低KDM6A的稳定性。缺失其E3连接酶活性所必需的RING结构域（ΔRING突变体）会损害RNF40与KDM6A的结合及其降解KDM6A的能力。泛素化实验证实，野生型RNF40能促进KDM6A的多聚泛素化，而ΔRING突变体则不能，且RNF40催化的是K6和K11连接的多聚泛素化。在RNF40敲除细胞中，KDM6A的K6和K11连接泛素化被显著削弱。
在Huh7.5细胞中敲除RNF40（而非KCMF1）能显著提高KDM6A蛋白水平（但不影响mRNA），并上调ACE2和DPP4的mRNA表达，同时促进SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV假病毒进入。在RNF40敲除细胞中回补野生型RNF40，而非ΔRING突变体，可以恢复对KDM6A的降解、下调ACE2和DPP4的表达，并抑制多种冠状病毒假病毒感染。这表明RNF40通过泛素化并降解KDM6A来限制病毒感染。
5. RNF40通过TAX1BP1介导的自噬降解KDM6A
研究者进一步探究了RNF40降解KDM6A的具体途径。通过抑制剂处理发现，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）和溶酶体抑制剂NH4Cl能恢复RNF40介导的KDM6A降解，而蛋白酶体抑制剂MG132则无此效果。在关键自噬蛋白ATG5和/或ATG7缺陷的细胞中，RNF40介导的KDM6A降解也被恢复，证明降解是通过自噬-溶酶体途径进行的。
自噬通常由自噬受体识别被泛素标记的“货物”而启动。互作筛选发现，KDM6A与自噬受体TAX1BP1特异性结合，而RNF40也与TAX1BP1强烈互作。有趣的是，过表达野生型RNF40（而非ΔRING突变体）能促进KDM6A与TAX1BP1的关联，而RNF40缺陷则会削弱这种关联。过表达TAX1BP1能降低KDM6A蛋白水平，且该效应可被自噬抑制剂而非蛋白酶体抑制剂逆转。在TAX1BP1缺陷细胞中，RNF40无法有效降解KDM6A。体外结合实验进一步证明，TAX1BP1特异性识别并结合被K6/K11连接泛素链修饰的KDM6A。
最后，在Huh7.5细胞中敲除TAX1BP1，会导致KDM6A和ACE2蛋白水平升高，上调ACE2和DPP4的mRNA表达，并促进多种冠状病毒假病毒的进入和复制。综上，RNF40通过催化KDM6A的K6/K11位点泛素化，使其被TAX1BP1识别，进而经由自噬途径降解，从而限制病毒感染。
6. 抑制USP7可消除多种病毒受体表达并阻断病毒感染
为了评估靶向USP7的治疗潜力，研究者使用了强效且选择性的USP7催化抑制剂FT671。在Vero E6细胞中，FT671以剂量和时间依赖的方式抑制ACE2和DPP4的mRNA和蛋白表达，并剂量依赖地抑制SARS-CoV-2原型的细胞病变效应和假病毒进入。在人源细胞Huh7.5和Calu-3中也观察到ACE2表达的抑制。为了验证抑制剂的特异性，研究者使用了另一种结构不同的不可逆USP7抑制剂XL177A，得到了相似的结果。更重要的是，在KDM6A敲除细胞中，FT671和XL177A均无法再下调病毒受体表达或抑制病毒感染，这从遗传学上证明了USP7抑制剂的作用依赖于KDM6A。
鉴于USP7-KDM6A轴也调控MHV受体Ceacam1，研究者在鼠源小胶质细胞BV2中进行了实验。结果显示，FT671或XL177A处理能剂量依赖地抑制Ceacam1表达和MHV-3的感染及假病毒进入。
7. 抑制USP7可在原代人细胞中阻断SARS-CoV-2和MERS-CoV感染
为了在生理相关模型中评估疗效，研究者在气液界面培养的原代人支气管上皮细胞（HBECs）中进行了实验。FT671处理降低了HBECs中ACE2和DPP4的表达，并抑制了SARS-CoV-2和MERS-CoV的病毒复制和产量，但对甲型流感病毒（IAV）的复制无影响，提示USP7抑制剂具有一定病毒特异性。
研究者进一步测试了FT671对多种SARS-CoV-2关切变异株（VOC）以及对直接作用抗病毒药（如瑞德西韦）耐药病毒的效果。FT671对包含RdRp突变E802D的瑞德西韦耐药毒株表现出比瑞德西韦本身更好的抑制效果，并且能有效抑制Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2) 和Omicron (B.1.1.529) 等多种变异株的感染。此外，在3D培养的原代人肠道类器官（HIEs）中，FT671预处理同样降低了ACE2和DPP4的表达，并抑制了SARS-CoV-2和MERS-CoV的感染。
8. 抑制USP7可降低小鼠体内KDM6A表达和病毒感染
最后，研究者在C57BL/6J小鼠体内评估了USP7抑制剂的治疗潜力。以15 mg/kg的剂量腹腔注射FT671，连续5天，未引起小鼠显著的体重下降，表明耐受性良好。FT671处理降低了小鼠小肠、脾脏、肝脏和肺组织中的KDM6A蛋白水平。同时，多个组织（脾、肝、肺）中MHV受体Ceacam1的mRNA表达也相应下降。与受体表达下降一致，FT671处理显著保护了小鼠免受MHV-A59感染，表现为感染后3天，脾脏、肝脏和肺组织中的病毒载量显著降低。
讨论
本研究揭示了一个以KDM6A稳定性为中心、由泛素化精细调控的环路，该环路决定了细胞对多种冠状病毒的易感性。USP7通过去除K48连接的多聚泛素链来稳定KDM6A，从而上调多种冠状病毒受体的表达并促进病毒进入。相反，E3泛素连接酶RNF40则通过催化K6和K11连接的泛素化，招募选择性自噬受体TAX1BP1，触发KDM6A的自噬性降解，从而限制病毒感染。这种拮抗性开关的存在，强调了细胞需要动态、精确地控制KDM6A蛋白水平，以平衡病毒感染与可能的免疫病理反应。
除了通过受体表达促进病毒感染外，USP7和RNF40可能还通过调控免疫信号通路（如I型干扰素和NF-κB通路）影响抗病毒防御，这为USP7抑制剂的广谱抗病毒效应提供了更多解释。本研究发现的RNF40驱动的、TAX1BP1介导的KDM6A自噬性降解，为理解病毒-宿主相互作用以及非蛋白酶体依赖的泛素化功能提供了新范式。
USP7和RNF40本身也受到转录和翻译后水平的严格调控，形成了一个复杂的调控网络，使细胞能够响应包括病毒感染在内的各种信号，精确平衡KDM6A稳态。值得注意的是，USP7和KDM6A在多种癌症和发育障碍中常发生突变，其功能具有双重性。因此，靶向该轴进行治疗时，需要仔细评估组织特异性效应和潜在长期影响。冠状病毒受体在特定组织中的限制性表达可能为此提供了一个治疗窗口。FT671在小鼠中的良好耐受性以及在原代人细胞中的高效抗病毒活性，突显了其治疗潜力。
总之，本研究揭示了一个精妙平衡的泛素化调控环路，它控制着KDM6A的稳定性，并主导细胞对多种冠状病毒的易感性。靶向该轴，特别是抑制USP7，为应对当前及未来的冠状病毒威胁提供了一种有前景的广谱策略。
