《Advanced Science》：High-Content SRS Imaging Unveils Altered Cholesterol Metabolism in Ovarian Cancers Under CAR-T Treatment
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本研究利用先进的高内涵受激拉曼散射（h2SRS）成像技术，在无标记条件下揭示卵巢癌细胞在CAR-T细胞攻击下的代谢适应。研究发现，存活的癌细胞表现出独特的胆固醇代谢重编程，其特征是脂滴中胆固醇酯（CE）和游离胆固醇（FC）的显著增加。进一步机制研究表明，这种代谢变化与CAR-T细胞释放的细胞因子（如TNF-α、IFN-γ）密切相关。靶向这一过程的胆固醇酯化酶ACAT-1抑制剂Avasimibe，能够有效抑制癌细胞迁移，并显著增强CAR-T细胞在2D及3D卵巢癌模型中的杀伤效果，为改善实体瘤CAR-T疗效提供了新的代谢干预策略。
1 引言
卵巢癌是全球致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，具有极高的复发率。尽管手术联合铂类化疗是目前的标准疗法，但多数患者在两年内复发，主要归因于铂耐药。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤中展现出显著疗效，然而其在实体瘤（包括卵巢癌）中的应用仍面临巨大挑战，原因在于肿瘤微环境的免疫抑制特性限制了T细胞的活性。研究表明，癌细胞的代谢改变可能参与了对免疫细胞攻击的抵抗。因此，理解CAR-T细胞攻击下癌细胞的代谢响应，对于提升其疗效至关重要。传统的代谢研究技术如质谱或荧光成像存在局限，无标记、非破坏性的振动光谱技术成为强有力的替代工具。其中，高内涵超光谱受激拉曼散射（h2SRS）成像能够在高分辨率下对活细胞进行多组分化学成像，为研究细胞代谢动态提供了新视角。本研究旨在利用h2SRS成像技术，探索CAR-T攻击下卵巢癌细胞的代谢变化，并寻找能够增强CAR-T疗效的代谢干预靶点。
2SRS成像系统示意图、光谱解混原理，以及SKOV3细胞在与CAR-T细胞共培养前后的脂质代谢变化对比图。可以看到，共培养后，癌细胞中的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TAG）信号显著增强，并且细胞形态出现突出物。">
2 结果
2.1 NIR h2SRS成像显示与CAR-T细胞共培养的卵巢癌细胞中脂质代谢改变及突起形成
为探究CAR-T细胞攻击下卵巢癌细胞的代谢变化，研究团队采用NIR h2SRS成像技术对卵巢癌细胞系SKOV3与抗HER2 CAR-T细胞的共培养体系进行分析。成像及光谱解混结果显示，与未受CAR-T攻击的SKOV3细胞相比，存活下来的共培养SKOV3细胞中，甘油三酯（TAG）和总胆固醇（TC）含量分别上调了3.5倍和2.3倍。同时，这些细胞出现了明显的膜突起，这是细胞处于应激状态的典型特征，并与癌细胞迁移和侵袭能力增强相关。这些发现提示，面对CAR-T攻击，卵巢癌细胞可能通过上调脂质代谢来作为生存机制。
2.2 Visible h2SRS成像揭示与CAR-T细胞共培养的卵巢癌细胞中游离胆固醇和胆固醇酯上调
NIR h2SRS成像分辨率不足以区分细胞内的细微结构。研究团队进一步利用新开发的、具有更高空间分辨率的Visible h2SRS系统进行成像。
2SRS生成的SKOV3细胞在共培养前后的TAG、TC、CE及FC化学图谱。高分辨率图像清晰地解析了细胞内微小的脂滴结构。">
分析显示，与CAR-T共培养后，SKOV3细胞内的TAG、游离胆固醇（FC）和胆固醇酯（CE）分别上调了2.3倍、4.5倍和1.7倍。通过将TAG图谱（标记脂滴区域）与TC图谱重叠，研究者成功将CE（主要储存于脂滴核心）与FC（主要存在于细胞膜）区分开来。在另一卵巢癌细胞系OVCAR5中也观察到了类似的脂质上调趋势。这一发现表明，胆固醇代谢重编程，尤其是FC和CE的积累，是卵巢癌细胞应对CAR-T攻击的关键适应性变化。
2.3 抑制胆固醇合成或酯化可抑制SKOV3细胞的迁移能力
基于上述发现，研究团队尝试通过药物干预胆固醇代谢来逆转癌细胞的侵袭性。他们分别使用了Simvastatin（抑制胆固醇合成的关键酶HMG-CoA还原酶，从而降低FC水平）和Avasimibe（抑制胆固醇酯化酶ACAT-1，从而降低CE水平）。
2SRS验证的药物效果。图中展示了药物处理后SKOV3细胞的TAG和TC图谱变化，以及Transwell迁移实验的荧光图像和定量结果，显示Avasimibe能更有效地抑制癌细胞迁移。">
实验证实，Simvastatin处理后，细胞内FC水平降至对照组的0.25倍；Avasimibe处理后，CE水平降至对照组的0.5倍。迁移实验显示，两种药物均能显著抑制SKOV3细胞的迁移能力，其中Avasimibe的效果尤为突出，使细胞迁移减少了95.5%，而Simvastatin减少了47.4%。值得注意的是，在细胞增殖抑制实验中，Simvastatin表现出更强的抑制效果。这说明胆固醇酯化通路（靶向CE）和胆固醇合成通路（靶向FC）对癌细胞的不同恶性表型（迁移 vs. 增殖）具有差异性影响。
2.4 Avasimibe处理增强了CAR-T细胞在2D癌细胞模型中的杀伤作用
接下来，研究团队评估了联合代谢干预与CAR-T治疗的抗癌效果。细胞毒性实验表明，使用Simvastatin预处理SKOV3细胞，未能显著增强CAR-T细胞的杀伤效果。然而，当使用Avasimibe预处理癌细胞时，CAR-T细胞的杀伤效率显著提升。
值得注意的是，仅在CAR-T细胞攻击前用Avasimibe预处理卵巢癌细胞（SKOV3或OVCAR5），即可获得最佳的协同杀伤效果。相比之下，预处理CAR-T细胞或同时预处理两者，效果均不及单独预处理癌细胞。这表明，通过Avasimibe使癌细胞代谢敏感化，同时保持CAR-T细胞的功能完整，是实现最佳治疗协同作用的关键。该结论在宽场荧光成像的二次验证实验中得到了证实。
2.5 Avasimibe处理增强了CAR-T细胞在3D肿瘤球体模型中的杀伤作用
为更贴近体内肿瘤微环境，研究在3D肿瘤球体模型中重复了上述实验。将GFP标记的SKOV3细胞培养成球体后，用Avasimibe预处理，再与CAR-T细胞共培养。结果表明，在较高的效应器与靶细胞比例（E:T = 5:1）下，Avasimibe预处理组的细胞毒性指数达到0.62，显著高于未处理对照组，并且Avasimibe单独处理不会对球体产生直接毒性。这进一步在更复杂的3D模型中验证了Avasimibe增强CAR-T疗效的潜力。
2.6 细胞因子影响癌细胞的脂质和胆固醇代谢
为了探究CAR-T细胞诱导癌细胞代谢改变的分子机制，研究关注了CAR-T细胞释放的关键促炎细胞因子，包括白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）。实验发现，用这些细胞因子单独处理SKOV3细胞，均能诱导其TAG和TC水平上调，其中TNF-α的作用最为显著。迁移实验也显示，TNF-α处理使癌细胞迁移增加了近100%。进一步的细胞因子中和抗体阻断实验证实，阻断IFN-γ或IL-2能将CAR-T诱导的TC水平升高恢复至基线水平；而阻断TNF-α仅能部分降低TC，但会显著降低TAG水平。这说明，CAR-T细胞分泌的细胞因子是直接驱动癌细胞脂质代谢重编程的关键介质，且不同细胞因子通过不同机制调控不同的脂质类别。
2SRS成像图谱显示TNF-α、IFN-γ和IL-2均能上调细胞内的TAG和TC；Transwell迁移实验图片和定量结果则显示TNF-α对促进癌细胞迁移的作用最强。">
3 讨论
本研究利用NIR和Visible h2SRS成像技术，首次直观地揭示了卵巢癌细胞在应对CAR-T攻击时发生的胆固醇代谢重编程，其特征是FC和CE在细胞内的积累。这种代谢改变与细胞迁移能力的增强相关，可能帮助癌细胞逃避免疫攻击。其中，CAR-T细胞分泌的细胞因子，尤其是TNF-α，是驱动这一过程的重要因素。
研究发现，靶向胆固醇酯化的ACAT-1抑制剂Avasimibe，在抑制癌细胞迁移和增强CAR-T细胞杀伤效果方面，比靶向胆固醇合成的Simvastatin更有效。这可能是因为CE富集的脂滴作为脂质储备库，在支持癌细胞侵袭性和抵抗内质网应激方面扮演着比单纯胆固醇更关键的角色。抑制胆固醇酯化可打破这种保护状态，使癌细胞对CAR-T攻击更敏感。
可见光h2SRS技术凭借其高分辨率，在解析脂滴等亚细胞结构及代谢物分布方面展现出巨大优势，为研究包括神经退行性疾病在内的多种代谢性疾病提供了强大的无标记成像工具。尽管当前研究主要关注高波数C-H区域，未来结合指纹区成像将能更全面地描绘代谢通路变化。
4 材料与方法
本研究采用了SKOV3和OVCAR5卵巢癌细胞系，以及通过慢病毒转导构建的抗HER2 CAR-T细胞。通过MTS法进行细胞活力和增殖检测；使用Transwell小室进行细胞迁移实验并通过共聚焦荧光显微镜成像分析；利用96孔板和宽场荧光成像进行CAR-T细胞毒性评估；采用实验室自建的NIR和Visible h2SRS系统进行高内涵代谢成像，获取的原始图像数据经过SPEND自监督去噪后，使用像素级LASSO算法，参照纯化学物质（TAG、BSA、胆固醇、RNA、葡萄糖）的参考光谱进行光谱解混，最终生成各种生物分子的化学分布图。所有统计图表数据均表示为平均值±标准差，并使用未配对t检验进行组间差异分析。
