脂质体纳米限域实现I型光动力转换，协同光热-免疫疗法攻克肿瘤

《Advanced Science》：Liposomal Nanoconfinement Enables Type I Photodynamic Conversion for Synergistic Cancer Photothermal-Immunotherapy

本文介绍了一种多功能纳米平台（RhM-R837@Lip），该平台通过脂质体纳米限域将光敏剂RhM从II型光动力治疗（PDT）机制转换为I型PDT，显著抑制单线态氧（1O2）生成并增强超氧阴离子（O2•?）和羟基自由基（•OH）产生，同时实现高达56.1%的光热转换效率。共载免疫佐剂R837进一步刺激全身免疫应答，协同增强肿瘤根除效果，为克服肿瘤缺氧微环境和抑制转移提供了创新策略。

　　

摘要

本研究开发了一种新型的基于半花菁衍生物的脂质体纳米组装体——RhM-R837@Lip，旨在实现协同的光动力、光热和免疫治疗。该平台通过脂质体纳米限域作用，将光敏剂RhM从传统的II型光动力治疗（PDT）机制高效地转换为I型PDT机制，从而更适用于缺氧的肿瘤微环境。

引言

光疗法作为一种非侵入性、时空精度高的癌症治疗方式受到广泛关注。然而，传统的II型PDT严重依赖氧气，在肿瘤缺氧环境下疗效受限。相比之下，I型PDT通过电子或氢原子转移过程产生活性氧（ROS），如超氧阴离子（O₂^•?）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（•OH），对缺氧肿瘤展现出优势。同时，光热治疗（PTT）利用光热剂（PTAs）将光能转化为局部热量，诱导细胞凋亡或坏死。将I型PDT与PTT结合，并与免疫疗法协同，有望实现对肿瘤的有效消融并激发全身性抗肿瘤免疫。

RhM-R837@Lip的制备与表征

研究人员合成了一种具有给体-π-受体（D-π-A）结构的半花菁染料RhM，并通过薄膜水化法将其装载入脂质体（RhM@Lip）。随后，利用pH梯度法远程装载Toll样受体（TLR）7/8激动剂咪喹莫特（R837），最终形成多功能纳米组装体RhM-R837@Lip。

动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）显示，RhM-R837@Lip形成平均直径约130纳米的球形囊泡。紫外-可见光谱显示，游离的RhM在水溶液中容易自聚集，最大吸收峰在740纳米；而RhM@Lip和RhM-R837@Lip在磷酸盐缓冲液（PBS）中的最大吸收峰红移至840纳米，表明脂质体为RhM提供了疏水性微环境，使其保持良好的近红外（NIR）光学特性。其摩尔消光系数达到5.91×10⁴M^-1cm^-1，约为游离RhM的两倍。

体外光物理性质

在808纳米激光照射下，RhM@Lip和RhM-R837@Lip在10分钟内可引起约25°C的温升，显著高于游离RhM（18°C），其光热转换效率高达56.1%，且具有良好的光热稳定性。使用特异性荧光探针检测ROS生成：游离RhM显示出强烈的单线态氧（¹O₂）信号，而RhM@Lip和RhM-R837@Lip的¹O₂生成被显著抑制。相反，RhM-R837@Lip显著增强了羟基自由基（•OH）和超氧阴离子（O₂^•?）的生成。电子自旋共振（ESR）光谱进一步证实，脂质体包裹后，RhM从II型PDT机制转变为以自由基介导为主的I型PDT机制。

体外细胞摄取与亚细胞定位

RhM-R837@Lip主要通过能量依赖性的网格蛋白介导的内存作用进入4T1细胞。共定位实验表明，其荧光信号与溶酶体示踪剂LysoTracker Green高度重合，说明纳米颗粒主要积累在溶酶体中。时间依赖性摄取实验显示，细胞内荧光强度在孵育12小时达到峰值。

体外抗肿瘤活性

通过CCK-8实验评估了不同制剂对多种肿瘤细胞系的细胞毒性。在808纳米激光照射下，RhM@Lip和RhM-R837@Lip表现出显著的、浓度依赖性的细胞杀伤作用，而R837@Lip及未经光照的组别则无明显毒性。流式细胞术分析显示，RhM-R837@Lip + 激光处理诱导了最高比例的晚期凋亡或继发性坏死。使用DCFH-DA探针检测细胞内总ROS水平，证实光照后ROS显著增加。进一步的探针实验（HPF、DHE、SOSG）和活/死细胞染色、线粒体膜电位（MMP）检测均证实，RhM-R837@Lip主要通过I型PDT机制杀伤肿瘤细胞。

体外免疫应答

RhM-R837@Lip在激光照射下能够有效诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。免疫荧光和酶联免疫吸附试验（ELISA）结果显示，与对照组相比，RhM-R837@Lip + 激光处理显著增强了钙网蛋白（CRT）在细胞表面的暴露，促进了高迁移率族蛋白B1（HMGB1）从细胞核向胞质的转位和释放，并增加了细胞外三磷酸腺苷（ATP）的分泌。这些损伤相关分子模式（DAMPs）的释放有利于激活后续的免疫反应。

体内抗肿瘤效应

在4T1原位肿瘤模型中，尾静脉注射荧光标记的RhM-R837@Lip-Cy7后，肿瘤部位的荧光信号在12小时达到最强，表明其具有良好的肿瘤靶向性和富集能力。体内光热成像显示，注射RhM-R837@Lip并照射激光后，肿瘤部位温度在5分钟内升高约13.5°C。在14天的治疗期间，RhM-R837@Lip + 激光组对肿瘤生长的抑制效果最为显著。苏木精-伊红（H&E）染色和Ki-67免疫组化分析进一步证实了其强大的肿瘤消融能力和抑制细胞增殖的作用。此外，该治疗还成功在体内诱导了ICD，并促进了CD3⁺/CD4⁺和CD3⁺/CD8⁺T细胞在肿瘤组织的浸润。

体内系统性抗肿瘤免疫反应

流式细胞术分析显示，与对照组或单一疗法组相比，RhM-R837@Lip + 激光处理能更有效地促进引流淋巴结和肿瘤内树突状细胞（DCs）的成熟（CD80⁺/CD86⁺）。同时，该疗法显著提高了脾脏和肿瘤中CD3⁺/CD4⁺和CD3⁺/CD8⁺T细胞的比例，减少了肿瘤内调节性T细胞（Tregs）的数量，并上调了促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的水平。这些结果表明，RhM-R837@Lip介导的疗法能够有效激活全身性抗肿瘤免疫应答。

对远端肿瘤的抑制作用

在建立了原发性肿瘤后，于对侧接种4T1细胞形成远端肿瘤模型。实验结果表明，经RhM-R837@Lip + 激光治疗原发灶后，远端肿瘤的生长受到显著抑制，其体积和重量均远小于对照组。免疫荧光分析显示，在远端肿瘤中也观察到了CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润的增加，证明了该疗法能够产生“远隔效应”，激发系统性免疫以抑制转移灶。血清生化分析和主要器官的H&E染色未发现明显异常，证实了RhM-R837@Lip的系统给药具有良好的生物安全性。

结论

本研究成功构建了集I型PDT、PTT和免疫疗法于一体的多功能脂质体纳米平台RhM-R837@Lip。该平台通过脂质体纳米限域作用，将光敏剂RhM从II型PDT高效转换为I型PDT，显著增强了自由基的产生并抑制了¹O₂生成，同时实现了高达56.1%的光热转换效率。共载的免疫佐剂R837协同光疗诱导的ICD，共同激活了强大的全身性抗肿瘤免疫，不仅有效消融了原位肿瘤，还抑制了远端转移瘤的生长。这项工作为克服肿瘤缺氧微环境、实现高效的PDT和抑制肿瘤转移提供了一种创新的、具有广阔应用前景的策略。