《Advanced Science》：Lewis Pair-Engineered CuMnOx as Cold-Adapted Multinanozyme for Cooperative Hydrolytic and Oxidative Degradation of Raw Corn Stalk
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本文报道了一种通过构建同时引入锰空位和氧空位的缺陷型铜掺杂氧化锰纳米酶（D-CuMnOx），从而创建路易斯酸-碱协同催化中心的创新策略。该纳米酶兼备强效的水解糖苷键活性（如糖苷酶，GHs）与稳定的氧化酶样活性，并表现出优异的冷适应性。研究表明，其独特的缺陷结构形成的路易斯对能够协同降低水解与氧化反应的能量壁垒，使其能够在室温和低温条件下，协同作用于木质纤维素三大组分——纤维素、半纤维素和木质素的同步降解，为生物质全组分温和高效转化为增值化学品提供了具有前景的人工酶平台。
1 引言
木质纤维素作为地球上最丰富的可再生碳资源，是替代化石原料生产生物燃料和高值化学品的理想选择。然而，其由纤维素微纤丝嵌入半纤维素和木质素基质构成的高度交联结构，使其天然抗拒降解，尤其是在温和条件下的全组分利用方面。传统的生物催化策略依赖微生物菌群或水解与氧化酶的鸡尾酒疗法，但面临稳定性差、生产成本高，尤其在低温下效率低下的挑战。纳米酶作为一类结合了高活性和操作稳定性的人工催化剂，为解决这些难题提供了新思路。然而，现有研究对水解型纳米酶，特别是具有冷适应性的、以及能够同时耦合水解与氧化功能的多家族系统关注甚少。
2 结果与讨论
2.1 结构与缺陷表征
研究通过铜掺杂与非晶化工程相结合的策略，合成了缺陷型铜掺杂氧化锰纳米酶（D-CuMnOx）。结构表征显示其为片状纳米片。高分辨透射电镜证实其内部同时存在非晶区和晶区。能量色散X射线光谱元素分布图证明了铜（Cu）、锰（Mn）和氧（O）在纳米片中的均匀分布。
3-FT Mn K-edge EXAFS spectra, (i) O1s XPS spectrum, (j) EPR spectrum, (k) CO2-TPD and (l) NH3-TPD profiles.">
X射线吸收光谱、X射线光电子能谱和电子顺磁共振谱等分析强有力地证实了D-CuMnOx中同时存在锰空位（VMn）和氧空位（VO）。与仅含氧空位的对照样（CuMnOx）相比，D-CuMnOx具有更高比例的VO。锰空位的引入导致电荷失衡，促使邻近锰离子氧化，增加了Mn3+和Mn4+的比例，有利于增强氧化酶样活性。程序升温脱附实验进一步证明，D-CuMnOx同时存在中等强度的路易斯酸位点和路易斯碱位点，而这些位点在CuMnOx中几乎不存在。这些结果共同证实了D-CuMnOx中由缺陷诱导产生的路易斯酸-碱对位点。
2.2 D-CuMnOx的冷适应糖苷酶样活性
受其与天然水解酶相似的路易斯对结构启发，研究以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）为模型底物，评估了D-CuMnOx的糖苷酶样活性。结果表明，D-CuMnOx能够高效切割pNPG的糖苷键，释放对硝基苯酚（4-NP）。其催化活性比CuMnOx高出约4倍，并优于此前报道的多种锰基纳米材料。
尤为突出的是，D-CuMnOx表现出优异的冷适应性能。当温度从50°C降至-10°C时，其仍能保留约72.2%的催化效率，这是目前任何水解型纳米酶所未报道过的特性。动力学分析表明，在0°C下，其米氏常数（Km）与37°C时相当，表明低温下底物亲和力得以保持。此外，D-CuMnOx对多种二糖（如纤维二糖、木二糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖）均表现出广泛的底物水解能力，并能在0°C下保持显著活性，证明了其广谱、冷适应的水解能力。
2.3 糖苷酶样与冷适应催化机制
同位素标记实验证实了反应遵循水解途径，水分子中的氧原子被整合到生成的葡萄糖中。通过吡啶和吡咯选择性淬灭实验，明确了路易斯酸位点和碱位点的协同作用对于D-CuMnOx的高效催化至关重要。在低温下，路易斯酸位点成为催化的主要驱动力。基于此，提出了一个双位点催化机制：缺陷锰作为路易斯酸位点，质子化糖苷键氧原子；相邻的氧或氧空位作为通用碱，去质子化亲核水分子，协同促进糖苷键断裂。
218O labeling and (b) mass spectra of glucose. Quenching experiments targeting different active sites (c) at low temperatures (d). (e) Proposed hydrolytic mechanism of D-CuMnOx. (f) Molecular models of CuMnOx (top) and D-CuMnOx (bottom). (g) Energy profile of the hydrolysis reaction on the surface of the nanozyme and the corresponding indeterminate.">
密度泛函理论计算为实验观察提供了理论支持。与仅含VO的CuMnOx相比，D-CuMnOx对pNPG的吸附能更低，且水解反应的整体能垒显著降低，表明其提供了热力学上更有利的反应路径。
2.4 多糖降解
研究进一步评估了D-CuMnOx对纤维素和半纤维素（木聚糖）这两种多糖的降解能力。3,5-二硝基水杨酸（DNS）法和葡萄糖检测均证实了还原糖的生成。傅里叶变换红外光谱显示，处理后样品中代表糖苷键C-O-C伸缩振动的1030 cm-1峰显著减弱，表明多糖链断裂。
核磁共振氢谱中出现了代表新生低聚糖或单糖质子的新峰。扫描电镜观察显示，原本长条状的纤维素纤维被破碎成小块，致密的半纤维素结构也被破坏成不规则纳米颗粒，并伴有显著的重量损失。重要的是，这些结构变化在0°C下与37°C下基本一致，证明了D-CuMnOx即使在低温下也能有效解聚多糖。
2.5 玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素的同步降解
除了水解活性，高效的木质纤维素降解还需要氧化酶样活性的协同贡献。研究表明，D-CuMnOx对典型的漆酶样底物（2,4-二氯酚）和氧化酶样底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）均具有催化氧化能力。以愈创木基甘油-β-愈创木基醚（GGE）为模型化合物的实验证实，D-CuMnOx能有效裂解木质素中最丰富的β-O-4连接键。
利用D-CuMnOx先进的水解和氧化特性，研究评估了其在单一体系中对天然玉米秸秆三大组分的同步解聚潜力。处理后，秸秆在37°C和0°C下分别实现了35.7%和28.5%的重量损失转化率。红外和X射线衍射分析证实了木质素、半纤维素和纤维素的结构均被破坏。DNS法和葡萄糖检测证实了还原糖和葡萄糖的生成。气相色谱-质谱联用分析鉴定出烷烃、醇、酸、醚、酯和酚类等多种产物，其中酸和醇占主导，揭示了水解与氧化共同作用的转化过程。三维荧光光谱显示了溶解性有机物组成的变化。扫描电镜图像直观展示了秸秆从完整光滑的棒状结构到破碎片段的形态转变。总有机碳分析和三大组分质量平衡计算进一步定量证实了D-CuMnOx在宽温度范围内高效降解玉米秸秆各组分的能力，其中木质素的降解率最高。
基于以上结果，文章提出了一个模拟天然木质素降解酶系的氧化-水解协同机制：纳米酶优先攻击木质素中最不稳定的β-O-4键，引发自由基链式反应，导致木质素结构严重破坏；木质素的初始分解暴露出内部的纤维素和半纤维素，使得它们能够被同步水解为可溶性糖和寡聚物。这种在温和条件下的协同双功能，实现了三大主要组分的同步降解。
3 结论
总而言之，本研究通过整合铜掺杂与非晶化工程，开发了一种冷适应多功能纳米酶D-CuMnOx。其同时引入的锰空位和氧空位产生了缺陷诱导的路易斯酸-碱对，作为协同催化中心，使D-CuMnOx兼具水解与氧化活性，并拥有卓越的冷适应性。机理研究表明，路易斯对促进了质子转移和水活化以裂解糖苷键。密度泛函理论计算揭示了其降低的能垒和优化的吸附态。因此，D-CuMnOx能在0°C下催化二糖和多糖的广谱水解，并进一步驱动原始玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的同步解聚。这项工作不仅为设计具有集成冷适应功能的多纳米酶建立了概念框架，也为实现木质纤维素全组分利用及绿色生物转化为高值化学品开辟了新途径。
