靶向炎症微环境的中性粒细胞仿生纳米清除剂：协同清除NETs/ROS并调控cGAS-STING通路治疗脓毒症相关急性肾损伤

《Advanced Science》：Neutrophil-Mimetic Nanoscavengers Target the Inflammatory Microenvironment to Eliminate NETs/ROS and Immunomodulate cGAS-STING Signaling in Septic AKI

本文报道了一种新型中性粒细胞膜仿生纳米平台（MD@NM），其核心为装载DNase-1的Mn3O4纳米酶。该平台能主动靶向受损肾脏，通过模拟多种酶活性有效清除活性氧（ROS），并利用DNase-1降解中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），从而抑制cGAS-STING信号通路，促进巨噬细胞向修复性M2表型极化，在脓毒症相关急性肾损伤（SAKI）小鼠模型中展现出优异的肾脏保护和免疫调节疗效。

　　

1 引言

脓毒症相关急性肾损伤（SAKI）是危重症患者中发病率和死亡率均较高的严重疾病，其病理机制复杂，涉及过度的氧化应激和免疫炎症失调。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的异常形成和先天性免疫的持续激活是加重肾损伤的关键因素。脂多糖（LPS）诱导的脓毒症会引发剧烈的炎症和氧化应激，导致活性氧（ROS）过量产生和细胞损伤。传统抗氧化剂和酶疗法因稳定性差、催化活性不足而受限。纳米酶，如Mn₃O₄，因其类酶活性和良好的生物相容性，展现出应用潜力。然而，单纯清除ROS不足以完全逆转SAKI。研究表明，NETs释放的细胞外DNA可作为病原相关分子模式，激活胞质DNA感受器cGAS，进而触发cGAS-STING信号通路，产生I型干扰素和促炎细胞因子，加剧炎症环境。因此，同时靶向ROS和NETs，并调节下游免疫信号，是治疗SAKI的新策略。脱氧核糖核酸酶I（DNase-1）能有效降解NETs的DNA骨架。受此启发，本研究开发了一种多功能的中性粒细胞仿生纳米清除剂（MD@NM）。

2.1 NETs与炎症通路驱动SAKI的转录组学洞察

通过分析SAKI患者及小鼠模型的转录组数据，发现与健康对照相比，SAKI组NETs形成评分和中性粒细胞活化显著升高。肾组织RNA测序显示，LPS处理组与假手术组之间存在大量差异表达基因。主成分分析和热图分析均表明SAKI模型存在显著的炎症转变。基因本体和京都基因与基因组百科全书富集分析揭示，NETs形成、DNA感知和cGAS-STING信号通路在LPS组肾脏中被显著激活。这些通路之间存在强关联性，表明NETs通过释放细胞外DNA，可能通过激活cGAS-STING轴加剧炎症。免疫荧光分析进一步证实，LPS组肾组织中存在广泛的NETs积累。

2.2 MD@NM纳米清除剂的制备与表征

MD@NM由装载DNase-1的Mn₃O₄纳米酶核心（MD NPs）包裹中性粒细胞膜构成。透射电镜显示Mn₃O₄纳米酶呈单分散球形，MD@NM具有清晰的核壳结构。元素映射证实了Mn、O、N、P、S元素的均匀分布。X射线光电子能谱和X射线衍射分析表明，功能化过程未改变锰的氧化态和Mn₃O₄的晶体结构。傅里叶变换红外光谱验证了Mn₃O₄、DNase-1和膜组分的整合。电泳实验证明MD@NM能有效降解DNA，表明DNase-1活性得以保留。蛋白质印迹分析证实了关键趋化和粘附相关膜蛋白的保留。MD@NM展现出多重的ROS清除活性，包括超氧化物歧化酶样活性、过氧化氢酶样活性、分解H₂O₂释放O₂以及清除羟基自由基的能力。3O₄纳米酶的TEM图像；(b) MD@NM的TEM图像；(c) MD@NM的元素映射；(d-e) XPS谱图；(f) XRD图谱；(g) FTIR光谱；(h) 粒径和Zeta电位；(i) 琼脂糖凝胶电泳；(j) SDS-PAGE蛋白分析；(k) 膜蛋白保留的蛋白质印迹验证；(l-o) ROS清除能力评估。">

2.3 体外清除ROS以缓解氧化应激

在LPS诱导的氧化损伤体外模型中，MD@NM展现出优异的细胞保护作用。细胞活性检测和活死细胞染色表明，MD@NM能显著减轻LPS引起的细胞死亡，并有效恢复细胞活性。共聚焦显微镜和流式细胞术分析显示，中性粒细胞膜伪装显著增强了MD@NM被炎症状态下的肾小管上皮细胞的识别与内吞效率。膜上的CXCR2和LFA-1分子介导了这种主动靶向行为。此外，MD@NM能显著降低LPS诱导的细胞凋亡率。通过DCFH-DA探针检测发现，MD@NM处理能有效降低细胞内的ROS水平。

2.4 抑制NETs形成

在LPS刺激下，中性粒细胞释放大量胞外DNA，形成NETs。SYTOX Green染色显示，MD@NM能最有效地减少胞外DNA的释放。免疫荧光和酶联免疫吸附测定结果进一步证实，MD@NM处理显著降低了NETs标志物（如瓜氨酸化组蛋白H3和髓过氧化物酶）的表达水平以及NETs相关酶的含量。

2.5 免疫调节cGAS-STING通路与重编程巨噬细胞极化

MD@NM通过降解NETs来源的DNA，减少了胞质中双链DNA的积累，从而抑制了cGAS-STING信号通路的激活。蛋白质印迹分析表明，MD@NM处理显著下调了cGAS、STING、磷酸化STING、IRF3和磷酸化IRF3的表达。这种信号抑制导致巨噬细胞极化表型的转变：促炎的M1型巨噬细胞减少，而抗炎的M2型巨噬细胞增加。细胞因子检测结果显示，MD@NM处理降低了促炎因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的分泌，同时升高了抗炎因子IL-10的水平。

2.6 MD@NM纳米清除剂在SAKI小鼠模型中的体内疗效

在LPS诱导的SAKI小鼠模型中，静脉注射MD@NM后，离体荧光成像显示其能主动靶向并大量积聚在受损的肾脏，其肾脏积累量显著高于未包裹膜的MD纳米颗粒。MD@NM治疗显著改善了肾脏的外观肿胀和充血。组织学分析显示，MD@NM减轻了肾小管损伤、肿胀和管型形成，恢复了刷状缘的完整性。同时，MD@NM治疗显著降低了反映肾功能的血清肌酐和血尿素氮水平，并减少了肾脏中促炎趋化因子CXCL1和CXCL2的表达。

2.7 SAKI小鼠的免疫治疗效果

MD@NM展现出多方面的免疫治疗作用。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法和免疫组织化学分析表明，MD@NM能显著减少肾小管上皮细胞的凋亡。免疫荧光显示，MD@NM处理减少了肾脏中中性粒细胞的浸润和NETs的形成。同时，MD@NM促进了巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转变。流式细胞术分析证实了肾脏中Ly6G阳性中性粒细胞数量的减少。血清细胞因子检测表明，MD@NM能系统性地抑制促炎细胞因子的释放，并提升抗炎因子IL-10的水平。

2.8 重编程肾脏转录组并调控NETs-cGAS-STING轴

对MD@NM治疗组和假手术组肾脏的RNA测序分析表明，MD@NM能显著下调大量与炎症相关的基因。主成分分析显示，MD@NM组的转录谱更接近假手术组。基因本体和京都基因与基因组百科全书通路富集分析证实，MD@NM抑制了与NETs形成、cGAS-STING激活、I型干扰素反应和先天免疫激活相关的通路。热图显示NETs形成、氧化应激、凋亡和炎症相关的关键基因表达下调。蛋白质-蛋白质相互作用网络揭示了这些基因间的强关联性。免疫荧光分析再次证实MD@NM处理后肾脏NETs几乎消失。

2.9 MD@NM的体内生物安全性评估

一系列生物安全性评估表明MD@NM具有良好的生物相容性。血液生化指标和全血细胞计数未见明显异常。主要器官的组织学检查未发现损伤或炎症浸润。溶血率远低于安全阈值。药代动力学研究表明，锰元素在体内随时间逐渐清除。长期安全性评估也证实了其良好的生物相容性。

3 结论

本研究成功开发了一种中性粒细胞膜仿生的多功能纳米平台。该平台通过整合Mn₃O₄的ROS清除能力、DNase-1的NETs降解能力以及中性粒细胞膜的炎症靶向能力，协同作用于SAKI的多个病理环节：缓解氧化应激、抑制NETs形成、调节cGAS-STING通路、重编程巨噬细胞极化，最终有效减轻肾脏炎症、促进功能恢复。MD@NM为脓毒症诱导的器官损伤提供了一种有前景的纳米免疫治疗策略。