理解结晶成核的动力学和机制至关重要，因为它们决定了最终晶体的关键特性，包括尺寸分布、产率和形态。这一知识在众多应用领域中都具有重要意义。在工业领域，它支持大分子的结晶（如药物化合物[1]）、先进材料的设计[2]以及改进的生物催化剂的研究[3]；在基础研究中，它为结构生物学等领域提供了支持[4]。在医学背景下，大分子的相变在退行性疾病的发病机制中起着核心作用[5]，这进一步凸显了对成核过程深入理解和控制的需求。因此，全面掌握成核现象对于通过调控结晶条件和成核途径来调整材料性能至关重要。
经典的成核理论（CNT）[6]长期以来一直是一个主导的理论模型，该模型将成核描述为一个受体积自由能和表面自由能竞争控制的激活过程。然而，许多研究指出CNT模型存在系统性偏差[7],[8],[9],[10]，尤其是在液-液相分离（LLPS）边界附近[11]，那里增强的密度波动降低了成核能量障碍。这些发现促使人们提出了替代框架[12]，包括两步成核（TSN）模型[13],[14],[15]，该模型提出通过亚稳态的密集液滴簇进行成核[16]。这一机制已在多种蛋白质系统中得到验证，包括溶菌酶[17],[18],[19],[20]。最近的研究还表明，即使在不同晶型的聚合物中，如果它们的体积自由能和界面自由能相同，成核速率的差异也受到过冷溶液的局部结构组织的影响，这表明溶液结构对于理解成核过程至关重要[21]。
尽管成核过程非常重要，但由于其随机性、临界核的纳米级大小以及对系统参数的高度敏感性，以及杂质可能作为异质成核位点的存在，直接表征成核事件仍然具有挑战性[22]。因此，研究成核需要在大规模、受控条件下进行大量独立实验的统计分析。在这方面，微流控平台能够并行处理微升和纳升级别的液体体积，为高通量结晶和成核研究提供了强大的工具[23],[24],[25],[26],[27],[28],[29],[30],[31],[32]。这些方法还使我们能够系统地检验现有理论框架对成核过程的描述准确性。
阿克ella等人使用基于乳液的技术测量了存在聚乙二醇（PEG）时溶菌酶的成核速率，发现了两种不同的过程：一种与杂质相关的快速、温度无关的过程，以及一种与蛋白质聚集体相关的较慢、温度依赖的过程，后者可以通过光学显微镜观察到[26]。类似地，Galkin和Vekilov早期在液滴中研究了溶菌酶的成核[7],[33],[34]，他们注意到在LLPS边界附近成核速率显著增加，这归因于密度波动的增加以及密集液相对核的润湿作用，这与之前的理论研究结果一致[10]。Vekilov等人的发现一致表明，溶菌酶的成核速率并不符合经典理论的预测，这引发了关于成核机制的进一步质疑，并促成了两步成核（TSN）理论的产生[15]。
重要的是，多项研究在欠饱和和过饱和条件下都报告了溶菌酶溶液中蛋白质的自组装和聚集现象[35],[36],[37],[38],[39],[40]。20世纪60年代和70年代的早期沉降平衡研究已经证明了溶菌酶的可逆自组装，包括二聚化和更高阶寡聚体的形成，即使在欠饱和条件下也是如此[41],[42],[43]。原子力显微镜（AFM）进一步研究表明，四方晶系的溶菌酶晶体生长是通过二聚体的附着而非单个单体实现的[38]。Stradner等人的小角X射线散射（SAXS）研究发现了溶菌酶溶液中的平衡簇[37]；然而，这些观察结果后来受到质疑，Shukla等人认为散射特征是由单个分子间的相互作用引起的，而非稳定的簇[44]。最近的小角中子散射（SANS）和中子自旋回波（NSE）研究表明，通常归因于平衡蛋白质簇的散射特征实际上是由短程吸引和长程排斥共同作用产生的中间有序结构[39],[40]。因此，参与非经典成核途径的蛋白质聚集体或簇的精确性质（无论是TSN模型所提出的稳定液相聚集体、无序的非平衡结构、平衡簇，还是由分子间吸引作用引起的瞬态局部密集化）及其对成核机制的影响尚未完全明确。
在这项研究中，我们通过对其动力学和潜在溶液结构进行全面研究，解决了关于溶菌酶成核的这一未解问题。我们提出了一个包含500个独立温度控制纳升级反应器的高通量微流控系统，用于在宽温度范围内统计表征溶菌酶的成核过程。该平台能够对随机成核事件进行可靠的动力学测量，并通过动态光散射（DLS）实验来探测溶液中的局部蛋白质结构。这些方法共同使我们能够评估经典成核理论在溶菌酶中的应用性，并评估溶液中相互作用驱动的结构变化对成核过程的影响。
