《Journal of Molecular Liquids》：The discovery of novel AKT inhibitor (4-(purin-6-yl)piperazin-1-yl)(benzofuran-2-yl)methanone for treatment of myeloid neoplasms: Computer modelling, synthesis and biological activity
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设计合成4-（嘌呤-6-基）哌嗪衍生物AKT1抑制剂，通过分子动力学模拟和细胞实验证实其显著抑制单核细胞系中PD-L1（96.0%→36.0%）和TIM-3（70.0%→9.0%）表达，降低细胞毒性，并开发出无需色谱纯化的可扩展合成方法。
康斯坦丁·N·谢苗诺夫 | 埃琳娜·V·皮梅诺娃 | 弗拉基斯拉夫·A·索科洛夫 | 迪娜·A·谢尼奇金娜 | 娜塔莉亚·V·佩图霍娃 | 马克西姆·A·古列夫 | 古杰尼娅·Y·普拉托诺娃 | 德米特里·S·布格 | 蒂莫菲·A·皮亚季斯拜恩采夫 | 亚历山大·S·茹拉夫列夫 | 奥尔加·S·埃皮法诺夫斯卡娅 | 伊万·N·加波年科 | 阿莱娜·I·沙基罗娃 | 基里尔·V·莱皮克 | 尤里·B·波罗佐夫 | 瓦列里娅·A·伊萨科娃 | 伊万·S·莫伊谢耶夫 | 弗拉基米尔·V·沙罗伊科
圣彼得堡第一国立医科大学，列夫·托尔斯托戈街6-8号，197022，俄罗斯
摘要
设计并合成了一种新的4-(嘌呤-6-基)哌嗪衍生物，作为潜在的AKT1抑制剂。通过分子动力学模拟彻底研究了该化合物与酶活性位点之间的相互作用模式。在初步筛选生物活性后，选择(4-(嘌呤-6-基)哌嗪-1-基)(苯并呋喃-2-基)甲酮作为先导分子。对该化合物进行了广泛的生物活性研究，包括其对AKT1活性的抑制作用、在髓系细胞系中各种标志物的表达以及细胞毒性。结果表明，该先导化合物将Mono-Mac-1细胞的百分比从对照组的89.4±0.7%降低到41.3±6.2%。PD-L1检查点的百分比在对照组中为96.0±1.8%，添加先导化合物后降至36.0±2.9%；TIM-3的检查点在对照组中为70.0±1.5%，添加先导化合物后降至9.0±1.1%。根据获得的生物活性数据，可以得出结论：这种化合物是一种有效的AKT1抑制剂，能够下调髓系细胞系中多种检查点分子的表达。本文还介绍了一种可扩展的合成方法，无需对中间体和最终产物进行昂贵的色谱纯化。所得化合物通过现代物理化学分析方法进行了鉴定。
引言
尽管最近在理解髓系肿瘤（如高风险骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）的分子特征方面取得了进展，但这些疾病的长期生存率仍不超过25% [1]，[2]。由于人口老龄化、诊断技术的改进以及化疗和放疗在肿瘤学中的广泛应用，MDS的发病率正在上升。在60岁以上的人群中，发病率超过每10万人中有10例 [3]。大多数老年患者不适合接受具有治疗潜力的强化化疗和异基因造血细胞移植 [4]，[5]。目前针对高风险MDS的标准治疗方法包括使用低甲基化剂（HMA），这可以将无进展生存期（PFS）延长大约一年 [6]。对于AML，标准治疗方法是HMA与venetoclax的组合，根据遗传风险的不同，26-74%的患者可实现完全缓解，但长期缓解率在染色体类型良好的患者中为50%，而在染色体类型不良的患者中则为0% [1]。因此，人们付出了巨大努力来开发有效的针对MDS和AML的靶向疗法。
最新的进展包括引入gilteritinib用于治疗FLT3阳性的难治性AML [7]，revumenib用于治疗KMT2A AML [8]，以及脂质体形式的阿霉素和胞嘧啶（CPX-351）用于治疗老年人的原发性AML [9]。尽管取得了这些进展，但在改进治疗方法方面仍有很大空间。开发新的AML和MDS药物的一个有前景的方向是针对免疫微环境并增强免疫反应。这些髓系肿瘤显示出免疫检查点（IC）系统的复杂改变，包括PD-L1、CD80、PD-1、TIM3、VISTA、BTLA、GAL9、TIGIT等受体和配体的上调。其中一些改变与MDS和AML的生存结果有关 [10]，[11]，[12]，[13]，[14]。研究表明，某些检查点通路（主要是TIM3/GAL9）通过自分泌循环机制参与AML中白血病细胞的存活和增殖 [15]。基于这些发现，几种新方法已在临床试验中进行了评估。最初，抗PD-1抗体（包括nivolumab和pembrolizumab）与HMA联合用于MDS的研究中。在一些患者中，观察到了疾病稳定的最佳反应 [16]，[17]。对于难治性AML，仅在一些患者中记录到疾病稳定；而在成功诱导后使用pembrolizumab进行巩固治疗时，其无进展生存期与传统化疗相当 [19]。另一种针对TIM3的抗体sabatolimab在二期研究中显示与安慰剂相比没有改善无进展生存期的效果 [20]。此外，另一种抗CD47检查点抑制剂magrolimab在涉及MDS、AML和TP53突变AML患者的三项临床试验中进行了测试，但这些试验均未显示出比安慰剂更好的生存优势 [21]。负面临床结果的一个解释是这些改变的复杂性以及髓系细胞上IC表达的复杂性，这种表达也存在于健康个体中，并可能保护髓系造血免受T细胞自身反应的伤害 [10]。因此，找到更通用的策略来克服髓系白血细胞的IC屏障是一个重要的科学挑战。我们之前已经发现，某些信号通路抑制剂可以下调髓系细胞系中多种IC的表达，其中多激酶抑制剂索拉非尼和某些AKT抑制剂的效果最为显著 [22]。因此，我们尝试开发一系列AKT抑制剂，以评估它们在抑制髓系细胞膜上IC表达方面的效果。
在寻找新的AKT抑制剂的过程中，我们专注于含有哌嗪环的嘌呤骨架。环状胺片段（用黄色突出显示）是一个共同特征，使分子能够在受体位点保持稳定 [23]。
嘌呤可能包含一个铰链结合基团，添加另一个结构精细调整的氢键供体可能会改善所得化合物与AKT1蛋白的相互作用。在生理活性物质的合成中常用的分子之一是哌嗪。额外的氢键供体基团可能将供体-受体相互作用的数量从两个（如传统嘧啶结构中的）增加到三个或四个，从而提高结合亲和力。研究表明，嘧啶和嘌呤核心与哌嗪衍生物结合是设计AKT激酶抑制剂的有希望和有前景的骨架。这些化合物为与AKT的ATP位点结合提供了坚实的基础，而哌嗪基团可以改善药物的类似性质（图1）[24]。
为了进一步优化我们的设计，我们将必要的药效团整合到主骨架中，以创建额外的相互作用，从而稳定与目标蛋白的结合。在之前发表的研究中表明，嘌呤或7H-吡咯[2,3-d]嘧啶与哌啶或二氮杂环庚烷基团的组合可以形成一种有效的分子骨架，有效抑制AKT1。在这项当前研究中，我们专注于嘌呤-哌嗪衍生物，这些衍生物被设计为占据AKT活性位点内的关键结合区域，以提高抑制剂的整体亲和力和选择性。通过利用这些结构修饰，我们旨在开发一类具有改进疗效和潜在治疗益处的新AKT抑制剂。生成了一个包含超过3000种潜在AKT1抑制剂的大规模虚拟库。图2显示了最有效的AKT激酶抑制剂，其中一些是由我们的研究小组合成的 [25]。
在这项研究中，我们筛选了在上述AKT1抑制剂存在下人类单核细胞系（Mono-Mac-1）的存活情况，以确定先导化合物。随后，我们重点研究了这种先导物质(4-(嘌呤-6-基)哌嗪-1-基)(苯并呋喃-2-基)甲酮的生物活性，我们将其称为物质14。为此，我们开发了一种高效的合成路线，该路线具有良好的结果且可扩展，因此具有潜在的商业可行性。
结构非特异性筛选
为了减少虚拟筛选过程中假阳性结果的可能性，对库进行了非特异性过滤。筛选的第一阶段包括分析不符合“类药”结构概念的所有结构，这些结构由Lipinski规则定义（表1）。ChemBridge库被用作化学结构的来源。
使用QikProp模块在Maestro界面计算了基本化合物的性质。
计算机建模
AKT是PI3-激酶途径中的关键蛋白，参与细胞代谢、生长、增殖和细胞存活。研究表明，由于上游蛋白的突变，AKT在癌症中呈持续过表达 [44]，[45]。因此，抑制AKT已被提出作为癌症治疗的辅助手段，以提高患者的生存率。人们已经做出了大量努力来开发用于治疗的AKT抑制剂
结论
目前，MDS的标准治疗方法相比最佳辅助治疗可额外延长12个月的生存期，但大多数患者仍无法治愈。表达在髓系细胞表面的检查点抑制剂在肿瘤学疾病的治疗中发挥了重要作用。通过抑制免疫检查点（特别是PD-1及其配体PDL-1），已经克服了MDS中的药物耐药机制
CRediT作者贡献声明
康斯坦丁·N·谢苗诺夫：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念化。埃琳娜·V·皮梅诺娃：研究。弗拉基斯拉夫·A·索科洛夫：研究。迪娜·A·谢尼奇金娜：撰写 – 初稿，研究。娜塔莉亚·V·佩图霍娃：撰写 – 初稿，可视化，验证，研究，数据管理。马克西姆·A·古列夫：撰写 – 初稿，可视化，验证，研究，数据管理。古杰尼娅·Y·普拉托诺娃：研究。德米特里·S·布格：撰写 – 初稿，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了俄罗斯联邦卫生部（项目编号123030200028-7“开发用于治疗骨髓增生异常综合征的小分子检查点调节剂”）的财政支持。使用了圣彼得堡国立大学研究园区内的以下资源中心的设备：磁共振研究中心、化学分析与材料研究中心。
