《Diabetic Medicine》：Enhancing diabetic foot osteomyelitis diagnosis with metagenomics next-generation sequencing, proof of concept
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这篇综述性研究通过回顾性分析，对比了常规培养与宏基因组二代测序(mNGS)在糖尿病足骨髓炎(DFOM)诊断中的表现。研究发现mNGS能更全面揭示感染部位的微生物多样性，包括常规培养易漏检的厌氧菌和耐药基因，且高微生物多样性与临床不良结局相关，为DFOM的精准诊断和预后评估提供了新的潜在补充工具。
1. 背景
糖尿病足感染(DFI)是糖尿病患者未愈合伤口的严重并发症，其中20%会进展为糖尿病足骨髓炎(DFOM)。DFOM的临床管理高度依赖可靠的诊断工具，以便进行有效治疗并避免不良结局（如截肢，死亡率可达50%）。当前的诊断金标准是骨活检后进行常规微生物培养，但该方法耗时漫长（可长达14天），且优化于检测常见病原体，可能无法全面反映感染部位真实、复杂的微生物群落。特别是厌氧菌在培养中常常被低估。因此，亟需更快速、更全面的诊断方法。宏基因组二代测序(mNGS)技术的发展为无偏倚地揭示临床样本中的全部微生物组成提供了可能。本研究旨在探索直接对DFOM骨活检样本应用实时mNGS，评估其作为常规培养补充工具的潜力。
2. 方法学
本研究是一项回顾性试点研究，分析了来自9名糖尿病患者的10份骨活检样本（其中一份来自同一患者的两个部位）。所有样本均接受了为期14天的常规微生物培养和mNGS分析。样本来自法国尼姆大学医院糖尿病足参考中心，患者纳入标准包括：年龄>18岁，有感染临床体征，且在就诊前2周内未接受全身抗生素治疗。
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微生物学分析：组织样本按照欧洲指南进行匀浆，接种于多种培养基（巧克力琼脂、哥伦比亚血琼脂、布鲁氏菌琼脂等）进行需氧和厌氧培养，并使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对分离菌进行鉴定。药敏试验依据欧洲药敏试验委员会(EUCAST)指南进行。
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宏基因组学分析：从骨悬浮液中提取总DNA，使用牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technologies)的MinION平台进行测序，运行24小时。reads使用EPI2ME和Kraken 2软件进行实时分析，并利用CGE平台上的ResFinder和Virulence Finder工具预测抗生素耐药基因和毒力基因。
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统计分析：使用R软件和phyloseq包进行微生物组数据分析。评估α多样性（如观察到的操作分类单元OTUs数和香农Shannon多样性指数）和β多样性（基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析）。
3. 结果
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患者特征与分组：9名患者（7男2女，平均年龄59.5岁）的10份活检中，7份培养阳性，被确认为DFOM组；3份培养阴性但临床怀疑感染，作为对照组。
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常规微生物学发现：在DFOM组中，常规培养在14天孵育期内共鉴定出11种细菌，其中金黄色葡萄球菌(S. aureus)在5份阳性活检中被发现。对照组中，一份活检显示为多微生物需氧菌定植，另外两份无细菌生长。针对S. aureus的PCR检测结果与培养存在部分不一致。
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宏基因组学发现：mNGS在所有10份活检中总共检测到84种细菌，涵盖了常规培养发现的所有物种（除一种外）。DFOM组的微生物多样性显著高于对照组（香农指数：1.10 vs 0.14）。在属水平上，DFOM样本中最丰富的包括埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、念珠藻属(Nostoc)、分枝杆菌属(Mycobacterium)和克雷伯菌属(Klebsiella)。
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关键物种与临床关联：研究中最常检测到的菌种包括大肠杆菌(E. coli)、产酸克雷伯菌(C. koseri)、豪氏变形杆菌(P. mirabilis)、霍氏肠杆菌(E. hormaechei)和环境菌分枝杆菌(M. branderi)。值得注意的是，肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)在6份活检中被检测到，且均与不良临床结局相关，并常与厌氧菌共现。mNGS在6份活检中检测到厌氧菌，而培养仅在1份中检出。在一份最初报告为阴性的对照组活检（Biopsy-10）中，mNGS揭示了高度的微生物多样性（香农指数=1.1），包括K. pneumoniae和多种厌氧菌，该患者在7天内迅速发展为严重感染需要手术。
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功能基因分析：在一份活检（Biopsy-4）中，mNGS检测到β-内酰胺酶基因blaACT-14以及81个与致病性相关的基因，这为靶向治疗提供了额外信息。
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方法与结果比较：mNGS与常规培养在DFOM组的大部分活检中表现出良好的一致性，但mNGS额外发现了大量物种。在对照组中，mNGS在所有样本中都检出了细菌DNA。
4. 讨论
本研究为mNGS应用于DFOM诊断提供了概念验证。主要发现包括：
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更高的检出率与多样性：mNGS比常规培养能揭示更广泛的微生物多样性，包括被常规方法低估或漏检的厌氧菌和罕见病原体。
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微生物多样性作为预后指标：高微生物多样性（高香农指数）与更严重的DFOM和更高的截肢风险相关，提示微生物群落复杂性本身可能是感染严重程度的生物标志物。
- 3.
预测价值：在常规培养阴性的样本中，mNGS检测到的高多样性（特别是包含K. pneumoniae和厌氧菌）可能预示着感染的早期快速进展，具有潜在的预测价值。
- 4.
功能洞察：mNGS不仅能进行物种鉴定，还能检测抗生素耐药基因和毒力因子，为临床选择更精准的抗菌方案提供依据。
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技术挑战：研究也指出了mNGS面临的挑战，如样本中人类DNA比例过高影响测序深度、试剂污染引入背景噪音、以及检测到细菌DNA不一定代表活菌存在等。
5. 结论与意义
尽管存在样本量小、存储条件影响DNA质量等局限性，本研究结果表明，将实时mNGS整合到DFOM的常规诊断流程中，可以作为传统培养方法的有力补充。mNGS以其快速（<24小时）、相对经济且信息全面的特点，有望帮助临床医生更早、更全面地了解感染状况，区分定植与感染，评估预后风险，并指导靶向治疗，从而最终改善糖尿病足骨髓炎患者的管理和临床结局。未来的研究需要在大规模队列中验证这些发现，并优化样本处理和生物信息学分析流程以推动其临床转化。
