《Immunological Reviews》：The Thymus Regeneration Paradox: The Search for Stemness in an Involuting Organ
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本文围绕“胸腺再生悖论”——这个在儿童期便开始退化的器官为何仍保留再生潜能展开。作者系统梳理了从早期胸腺重建模型到干细胞克隆移植等关键技术，重点论证了胸腺上皮细胞（TEC）中存在具备长期自我更新和多向分化能力的“多能干细胞”（PolyKRT细胞）。这是人类首次从体外培养的体细胞成功重建功能性胸腺。文章不仅为器官再生研究提供了新范式，也为开发基于TEC的免疫重建疗法（如用于免疫缺陷或衰老相关疾病）奠定了理论基础。
1. 出乎意料的器官再生
胸腺是人体的中央免疫器官，负责产生和“教育”T细胞，是抵御感染和癌症的基石。然而，这个器官有着独特的“宿命”：它是人体最早衰老的器官，从儿童期就开始经历脂肪化萎缩，这一过程被称为“胸腺退化”。因此，胸腺长期被认为是出生后“无关紧要的进化意外”。临床上也常在儿童心胸外科手术中将其切除。
然而，近年来的发现正在颠覆这一认知。研究观察到，即使在老年个体中，仍残留有胸腺组织和未成熟的胸腺细胞。更引人注目的是，成年患者在化疗后会发生“胸腺反弹性增生”——化疗初期引起胸腺急性萎缩，治疗结束后却又大量再生。这些现象揭示了一个核心悖论：一个正在退化的器官，却保留着惊人的可塑性和再生能力。这暗示胸腺内可能潜藏着具有修复和再生能力的细胞，为针对衰老、癌症或自身免疫疾病患者进行免疫系统“年轻化”治疗提供了可能。
2. 先驱性胸腺重建模型中基质细胞功能的证据
为了解析胸腺再生的细胞基础，科学家们开发了多种体外模型。早期，小鼠胚胎胸腺器官培养（FTOC）技术使研究者能在体外维持胸腺小叶结构，研究T细胞发育。随后发展的重组胸腺器官培养（RTOC）技术，允许将胸腺上皮细胞、基质细胞和淋巴细胞按特定比例重组，从而精确剖析不同细胞亚群在胸腺微环境中的作用。
这些研究不仅证实了胸腺上皮细胞（TEC）在T细胞选择和发育中的核心作用，也揭示了间质/基质细胞（在成人和出生后胸腺中常称为胸腺间质细胞，TIC）的关键贡献。TIC在胚胎期帮助塑造胸腺微环境、支持上皮结构，在成年后则通过产生细胞外基质（ECM）和信号分子，持续支持TEC稳态和组织修复，并促进胸细胞成熟和迁出。然而，成体胸腺中间质细胞的起源至今仍是个谜。
虽然FTOC和RTOC模型极大地增进了我们对胸腺生理的理解，但它们高度依赖胚胎或小鼠组织，且难以模拟出生后器官稳态和再生的复杂过程，也无法精确解析单个细胞组分的作用。
3. 在胸腺中寻找上皮干细胞/祖细胞
在许多不断更新的组织中（如血液、皮肤、肠道），稳态维持和损伤修复依赖于长期存在的、具有自我更新能力的干细胞。那么，胸腺是否也拥有这样的细胞？
早期的研究通过不同表面标志物（如MTS24、MHCIIlowCD49fhighSca-1high等）试图分离胸腺上皮祖细胞，并通过体内移植实验证明其存在。然而，这些实验大多依赖胚胎微环境的支持，未能严格证明这些细胞的长期自我更新能力（即“干性”）。3D类器官培养技术的发展为扩增小鼠TEC提供了新工具。添加间质细胞衍生生长因子FGF7（亦称KGF）能有效促进TEC类器官的扩增，并能在特定信号诱导下分化为更成熟的皮质和髓质亚型。但这些系统仍存在局限性，例如难以支持高效的、生理性的胸腺生成，且对TEC内祖细胞的表征不完全。
总的来说，这些研究虽推进了我们对TEC生物学的认识，提供了上皮祖细胞存在的证据，但大多聚焦于胚胎发育阶段，且缺乏像造血干细胞（HSC）或表皮干细胞那样严格的克隆分析和连续移植实验来定义成体胸腺中真正的干细胞。
4. 将克隆干细胞和连续移植范式应用于胸腺上皮
真正的干细胞定义，在于其能够在体内自我更新，并能在体外长期培养后仍保持其完整的分化潜能。这一范式最早由Till和McCulloch在骨髓HSC中建立，后来被应用于表皮等上皮组织。
一项关键研究在大鼠模型中取得了突破。研究人员从不同年龄（胚胎期E16、出生后P1、4月龄）的大鼠胸腺中分离出表达增强绿色荧光蛋白（eGFP）的TEC，并在体外进行单细胞克隆培养。令人惊讶的是，这些细胞能在体外长期（超过13代）大规模扩增且保持稳定核型。当将这些克隆扩增的TEC与新鲜分离的胸腺细胞聚合后，移植到无胸腺裸鼠的肾包膜下，它们能够贡献于胸腺形态发生，形成具有三维结构的类胸腺组织，并重新表达MHC II类和AIRE（自身免疫调节因子）等功能分子，同时支持CD4+和CD8+单阳性及双阳性胸腺细胞的发育。
更惊人的是，这些克隆性TEC展现出非凡的可塑性。当被植入发育中的小鼠皮肤下并暴露于皮肤特异性信号时，它们能够参与表皮、皮脂腺和毛囊的形成。经过连续移植实验证明，这些细胞甚至能长期维持表皮更新，这是天然毛囊干细胞都无法做到的。而最令人信服的是，单个经过皮肤环境“重编程”的TEC，之后仍能返回胸腺并整合进其结构中。这些发现揭示了胸腺上皮干细胞此前未被充分认识的、广泛的发育潜能。
5. 人类胸腺中的干性
那么，在人类胸腺中，是否也存在类似的干细胞呢？单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术以前所未有的分辨率揭示了人类胸腺上皮细胞（TEC）的高度异质性。通过富集策略，研究者在皮质和髓质TEC中都发现了一个独特的细胞簇。这群细胞不表达任何髓质或皮质的特异性标志，却表达了其他组织中上皮干细胞的标志基因，如CEBPD、CLU、LIFR以及抗病毒反应基因CH25H、IFITM3。
最不寻常的是，这群细胞同时表达通常与不同上皮谱系相关的多种角蛋白（Keratin），包括与增殖性基底上皮细胞相关的KRT15，与终末分化层相关的KRT13，以及单层上皮角蛋白（KRT8, KRT19）和复层上皮角蛋白（KRT5, KRT14）。因其广泛的角蛋白表达谱，这群细胞被命名为“多角蛋白细胞”（PolyKRT）。空间转录组学分析显示，PolyKRT细胞优先定位于皮质的被膜下区域和髓质的血管周围，构成了潜在的干细胞生态位。
利用表面标志物BCAM，研究者成功前瞻性分离了PolyKRT细胞。尽管它们只占上皮细胞的很小一部分（皮质中<1%，髓质中<5%），但BCAM+的PolyKRT细胞在体外能形成长期自我更新的增殖集落，而占绝大多数的BCAM阴性细胞则完全没有这种能力。单细胞克隆分析进一步揭示了其异质性：根据形态和增殖潜力，可将其分为折光边缘型、分层型和流产型克隆。其中，只有折光边缘型克隆具有长期生长潜力，并能产生所有三种克隆类型，表现出干细胞特性。有趣的是，折光边缘型克隆表现出CD90+EpCAM-的非典型表面标志谱，暗示其具有间充质样特征，这可能反映了胸腺上皮网络独特的3D结构。
6. 干细胞潜能与人类胸腺的功能性从头重建
干细胞的“潜能”是指其分化成特定组织内一种或多种细胞类型的能力。证明人类胸腺上皮干细胞潜能的最大挑战在于开发能够展示其功能分化的可靠实验系统。
首先，在完全由上皮细胞组成、无其他支持细胞的环境中，克隆化的PolyKRT干细胞能够在体外自我组织并分化为主要的皮质TEC（cTEC）和髓质TEC（mTEC）亚型，证明了其内在的多能性。
然而，完全的功能成熟需要更复杂的环境。细胞外基质（ECM）在器官发育和再生中起着关键的指导作用。研究者利用脱细胞处理获得的天然胸腺ECM支架，将培养的人胸腺上皮细胞和间质细胞（TIC）共同种植其上。令人惊叹的是，即使是大鼠来源的ECM，也能在体外支持人细胞重演早期胎儿胸腺的形态结构。
最终的“终极大考”是在体内重建一个功能完整的人类胸腺。研究者将种植了PolyKRT干细胞和TIC的胸腺ECM支架，植入完全无胸腺的NSG-Nude小鼠体内。这些小鼠不仅免疫缺陷，而且由于Foxn1基因突变而彻底缺乏胸腺原基。
实验结果取得了里程碑式的成功：植入的PolyKRT干细胞不仅与TIC相互作用，还从人源化骨髓中吸引淋巴祖细胞，并支持其发育为CD3+胸腺细胞。在移植物内，PolyKRT来源的TEC自组织形成分明的皮质和髓质区室，表达了FOXN1、CD274、LY75、AIRE、HLA II类等胸腺功能关键分子，并产生了完全发育的胸腺髓质所具有的复杂细胞异质性，包括祖细胞（CLDN3/4+， ASCL1+）、哈索尔小体（KRT10+）、肌样细胞（MYOG+）、离子细胞（KRT7+）和神经内分泌mTEC（SYP+, SOX2+）等。更重要的是，这些新生的T细胞能够离开胸腺，重新填充小鼠的外周免疫系统，并在受刺激时产生细胞因子。
这项工作首次无可辩驳地证明了，从体外培养的体细胞（PolyKRT干细胞）出发，可以重建一个功能完备的人类胸腺。这不仅展示了器官水平的功能，也揭示了人类胸腺上皮干细胞固有的多谱系潜能及其产生包括多种“模拟”细胞在内的全部TEC亚型的能力。
7. 开放性问题与未来方向
长久以来未被充分重视的胸腺，正重新获得研究界的关注。传统的胸腺研究侧重于其作为T细胞成熟“教育环境”的免疫学功能。如今，随着在退化的成体胸腺中发现并证实了具有强大再生潜能的干细胞，胸腺研究正进入一个新时代。
PolyKRT干细胞模型的建立，为探索胸腺上皮细胞可塑性的分子基础、理解其如何产生胸腺髓质惊人的细胞多样性（特别是那些介导AIRE非依赖性组织特异性抗原呈递的“模拟”细胞）提供了关键工具。调控PolyKRT细胞的分化，可能进而影响对特定抗原的免疫耐受，这在生理和病理条件下（如自身免疫）都具有重要意义。
未来的研究将聚焦于几个核心问题：如何精确调控这些干细胞的命运？其微环境（生态位）如何随年龄变化而影响其再生能力？能否利用这些细胞开发出临床可用的、用于免疫重建的“胸腺类器官”或细胞疗法？对胸腺再生潜力的深入理解和有效利用，有望为基础科学和临床应用带来变革性的进展，为免疫缺陷、癌症免疫治疗后的免疫重建以及对抗与年龄相关的免疫衰退开辟新的道路。
