《Aggregate》：Golgi Apparatus-Associated Secretome Deciphering in Living Cells Enabled by Aggregation-Induced Emission Luminogen-Mediated Photocatalytic Proximity Labeling
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这篇研究论文开发了一种称为“聚集诱导发光（AIE）光敏剂介导的光催化邻近标记（AIE-PhoPL）”的新策略。它利用一种能特异性靶向高尔基体（GA）的AIE光敏剂（TPE-PyT-CPS），在光照几分钟内，即可在活细胞的高尔基体腔内高效、特异地标记和解析GA相关分泌蛋白质组（secretome）。该方法具有卓越的生物相容性、高时空精度和广泛的适用性，无需基因操作。研究成功将其应用于HeLa细胞、难转染的HMC3巨噬细胞，以及脑/骨转移肺癌细胞模型，揭示了不同细胞类型特异的GA分泌谱，并发现了与癌症转移相关的潜在调控因子（如MCAM、ALPP），为亚细胞水平的分泌调控机制研究提供了强大工具。
引言与挑战
高尔基体（GA）是真核细胞内膜系统的关键枢纽，负责蛋白质的加工、修饰、分选与分泌，其相关的分泌蛋白质组（secretome）对维持细胞内及细胞间的通讯网络至关重要。然而，由于缺乏特异、高效的活体内原位标记方法，解析动态变化的高尔基体相关分泌蛋白质组仍面临巨大挑战。遗传学方法如TurboID存在标记动力学较慢、难以应用于难转染细胞的局限，而传统的商业高尔基体富集试剂盒则存在空间特异性低、偏向于高丰度蛋白、且会丢失瞬态分泌蛋白信息等问题。
AIE-PhoPL策略的开发与机制验证
为解决上述难题，本研究开发了一种基于聚集诱导发光（AIE）光敏剂的光催化邻近标记策略，即AIE-PhoPL。该策略的核心是研究者前期设计的一种AIE光敏剂TPE-PyT-CPS，它具有分子棒状堆积结构和适当的亲脂性，能够自发地、高选择性地靶向并富集在高尔基体膜环境中。
该光敏剂在光照下被激发，既能通过能量转移（EnT）高效产生活性氧（1O2），也能通过单电子转移（SET）过程生成酪氨酸自由基（Tyr?+）。这两种活性中间体能够氧化并活化其邻近的蛋白质氨基酸残基（主要是组氨酸His和酪氨酸Tyr），使其能与加入的含炔基的核苷试剂3-乙炔基苯胺（3-EA）发生共价连接，从而实现对高尔基体腔内及转运过程中的蛋白质进行快速、共价标记。
实验证实，AIE-PhoPL对细胞扰动极小，不影响高尔基体结构蛋白（GM130， p115）的表达，细胞毒性低，且对全局蛋白质组的影响可以忽略不计。该策略在多种细胞系中均表现出有效标记能力，包括HeLa细胞以及难以进行基因操作的巨噬细胞HMC3和自然杀伤细胞NK92，显示了其卓越的鲁棒性和广泛的适用性。
高尔基体靶向与标记特异性验证
共聚焦成像显示，TPE-PyT-CPS与高尔基体商业化染料（Golgi green）的共定位系数高达0.91，证实了其优异的高尔基体靶向能力。通过点击化学反应标记生物素并利用链霉亲和素偶联物可视化，可以观察到在光照条件下，标记的红色荧光信号与高尔基体标记蛋白间皮素（MSLN）的绿色荧光信号高度共定位，证明了标记反应的光依赖性和高尔基体腔内特异性。
与商业高尔基体富集试剂盒相比，AIE-PhoPL将所获蛋白质组中高尔基体相关分泌蛋白质组的特异性从56.4%显著提升至92.1%。免疫印迹分析也证实，AIE-PhoPL能更有效地富集高尔基体标志蛋白（如GM130）、分选相关蛋白（如sortilin）以及瞬态定位的分泌蛋白（如MSLN， ITGB8），而试剂盒则更容易富集到其他细胞器的污染蛋白。
活细胞中高尔基体相关分泌蛋白质组的鉴定
利用该策略结合质谱技术，研究者在HeLa细胞中成功鉴定了654个高尔基体相关蛋白质，其中分泌蛋白质组有520个（特异性79.5%）；在HMC3细胞中鉴定了985个高尔基体相关蛋白质，其中分泌蛋白质组有796个（特异性80.8%）。通过开放式搜索质谱分析，进一步在活细胞中确认了标记位点主要为His和Tyr，验证了其标记机制。
功能分析显示，两种细胞的高尔基体相关蛋白质组既有共性，也表现出明显的细胞类型异质性。HeLa细胞的高尔基体分泌蛋白质组更多与细胞粘附和基底膜组织相关，符合其侵袭性特征；而HMC3巨噬细胞的则更富集于内吞作用、细胞形状调节以及蛋白质泛素化、磷酸化、糖基化相关酶类，反映了其作为吞噬细胞的功能特性。这一结果凸显了AIE-PhoPL在绘制不同细胞类型特异的高尔基体功能图谱方面的能力。
应用于癌症转移相关蛋白质组研究
鉴于高尔基体相关分泌蛋白质组在癌症等病理条件下的动态调控至关重要，研究者将AIE-PhoPL应用于具有高脑转移（BrM3）和骨转移（BoM）倾向的肺癌细胞模型，并模拟了缺氧条件。
在BrM3和BoM细胞中，该方法同样实现了高的高尔基体相关分泌蛋白质组特异性。差异表达蛋白分析揭示了转移细胞中分泌活动整体增强。值得注意的是，脑转移细胞高表达的蛋白质主要富集于细胞粘附、基底膜组织和细胞外基质构成等功能，这可能有助于其突破血脑屏障；而骨转移细胞高表达的蛋白质则与骨吸收、溶酶体组织和水解酶活性相关，符合其介导骨破坏的特性。此外，缺氧处理改变了差异表达蛋白谱，导致多个溶酶体蛋白下调，提示在缺氧应激下，溶酶体相关功能可能发生重塑以促进细胞存活和转移。
研究发现了一些与转移相关的关键蛋白。例如，黑色素瘤细胞粘附分子（MCAM）和胎盘碱性磷酸酶1（ALPP）在两种转移细胞中均表达上调。免疫印迹和免疫组织化学结果验证了质谱数据的可靠性，并显示MCAM在转移病灶中表达升高，而ALPP在原位腺癌中表达更高。这些发现揭示了MCAM和ALPP作为通过重塑细胞外微环境调控肺癌转移的潜在关键因子。
结论与展望
总而言之，AIE-PhoPL策略为活细胞内高尔基体相关分泌蛋白质组的原位解析提供了一种通用、高效、高时空精度的强大化学工具。它克服了传统方法的局限，能够捕捉瞬态或永久定位于高尔基体的蛋白质动态信息。研究不仅绘制了不同细胞类型特异的高尔基体分泌谱，还深入揭示了其在癌症转移过程中对细胞外微环境组织的关键作用。将AIEgens引入活细胞蛋白质组学领域，AIE-PhoPL有望成为未来高时空分辨率亚细胞蛋白质组绘图的通用平台，为生命科学和医学研究提供新的视角和工具。
