《Materials Today Bio》：Bipolar CD4-targeted dual-DARPin-55/57 lipid nanoparticle enables efficient CRISPR/Cas-mediated HIV-1 DNA excision and reactivation blockade in latent CD4 T cell lines.
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为解决HIV-1潜伏储存库难以根除的难题，研究人员开发了一种新型靶向递送平台。他们通过双极性偶联策略将CD4靶向的DARPin-55/57修饰于脂质纳米颗粒（LNP）表面，构建了双DARPin-LNP系统，用于向潜伏感染的CD4 T细胞选择性共递送spCas9-GFP mRNA和靶向HIV-1 LTR与Gag区的引导RNA（sgRNA）。该平台在潜伏感染细胞模型（J-Lat 10.6和2D10）中高效切除了整合的HIV-1前病毒DNA，并成功阻断了由潜伏反转剂（SAHA和TNFα）诱导的病毒再激活。这项研究为开发基于CRISPR/Cas的非病毒、受体引导的下一代HIV-1治愈性干预策略提供了概念验证。
在实现艾滋病功能性治愈的道路上，一个巨大的障碍始终横亘在前：HIV-1病毒在人体内建立的“潜伏储存库”。接受抗逆转录病毒治疗（ART）的患者血液中的病毒载量可以被压制到检测不到的水平，但只要治疗一中断，病毒就会迅速从这些储存库中“反弹”。这些潜伏的病毒就像一个沉睡的敌人，主要藏在静息状态的CD4 T细胞里。它们将病毒的遗传物质（前病毒DNA）整合进宿主细胞的基因组，却保持沉默不表达病毒蛋白，因此能完美地逃避免疫系统的识别和ART药物的攻击。彻底清除或永久沉默这些潜伏的前病毒，是实现“根治”艾滋病的终极目标。
尽管基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9系统，为精准切除整合的前病毒DNA带来了革命性的希望，但如何将这套强大的“分子剪刀”安全、高效且特异性地递送到为数稀少、分布广泛且处于静息状态的潜伏感染CD4 T细胞中，一直是临床转化的主要瓶颈。传统的递送工具，如病毒载体，存在免疫原性、包装限制和潜在的基因组整合风险；而非病毒载体，如脂质纳米颗粒（LNP），虽然生物相容性更好、更易规模化生产，却往往缺乏细胞靶向性，难以精准命中目标。
为此，来自弗吉尼亚联邦大学医学院的研究团队在《Materials Today Bio》期刊上发表了一项创新研究。他们巧妙地设计并构建了一种新型的“制导导弹”——一种双极性、CD4靶向的双DARPin脂质纳米颗粒（dual-DARPin-LNP），专门用于向HIV-1潜伏感染的CD4 T细胞递送CRISPR/Cas9基因编辑组件。这项研究不仅展示了一个高效、特异的递送平台，更为最终攻克HIV-1潜伏储存库这一难题提供了有力的新工具。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：
- 1.
双DARPin靶向分子工程与偶联：他们设计了融合蛋白DARPin-55/57，并通过一种创新的“双极性”偶联化学策略，将其稳定、方向可控地锚定在LNP表面，确保其CD4结合域朝外，实现了对CD4受体高亲和力、高特异性的靶向。
- 2.
冷链稳定的CRISPR/LNP共封装技术：采用改进的微流控配方和后续的“硬化”、透析纯化工艺，将spCas9-GFP mRNA与靶向HIV-1 LTR和Gag区的双sgRNA（LGsg）共同封装进LNP，并显著提升了LNP在4°C下的长期储存稳定性。
- 3.
基于潜伏细胞株模型的功效验证：研究使用两种广泛认可的HIV-1潜伏感染T细胞系模型——J-Lat 10.6和2D10细胞，来评估靶向LNP的递送效率和基因编辑效果。
- 4.
多维度基因编辑效果评估体系：通过标准PCR基因分型、绝对定量数字PCR（dPCR）、共聚焦显微成像和流式细胞术等多种技术，综合验证了前病毒DNA的切除效率以及病毒再激活被阻断的功能性结果。
以下是该研究的主要结果：
3.1. 用于定向LNP表面装载的双DARPin-55/57 (DR)的策略设计与纯化
研究人员成功表达并纯化了N端带有10×组氨酸标签、C端带有3×半胱氨酸的DARPin-55/57融合蛋白（DR）。通过创新的化学修饰策略，在蛋白的N端和C端引入了硫基（-SH），为后续与LNP表面的马来酰亚胺基团进行定向、稳定的共价偶联（形成硫醚键）奠定了基础，从而确保了DARPin在LNP表面的正确取向，使其CD4结合位点充分暴露。
3.2. 新型DR-Sp9m/LGsg LNP配方的设计、制备与表征
研究团队开发了一种冷链稳定的LNP配方，用于共同封装spCas9-GFP mRNA (Sp9m) 和靶向LTR与Gag的双sgRNA (LGsg)。通过引入有机相蒸发“硬化”和含分子淬灭剂的缓冲液透析等步骤，显著提高了LNP的封装效率和长期（4°C）稳定性。随后，通过“双极性”硫基-马来酰亚胺点击化学反应，将活化后的DR蛋白成功偶联到LNP表面，形成了靶向性的DR-Sp9m/LGsg LNP。理化表征显示，与未修饰的LNP相比，DR修饰后的LNP粒径增大，表面电位降低，且保持了良好的单分散性，证明DARPin被成功、均匀地偶联。
3.3. LNP表面展示DARpin改善了向静息CD4 T细胞的靶向递送
在人类外周血单个核细胞（PBMC）中进行的递送效率测试表明，与未靶向的LNP相比，DR修饰的LNP能更高效、更选择性地将spCas9-GFP mRNA递送至CD4 T细胞，并实现GFP蛋白的表达。虽然单核细胞也摄取了部分LNP，但其GFP表达并未因DARPin修饰而增强，这表明DR-LNP在CD4 T细胞中的高效递送是受体介导的特异性过程，而在单核细胞中主要是非特异性的吞噬作用。
3.4. DARPin-LNP递送spCas9 mRNA和双联LTR1/GagD sgRNA至HIV-1潜伏J-Lat 10.6细胞系，有效删除HIV-1前病毒DNA
在HIV-1潜伏感染的J-Lat 10.6细胞模型中，DR-Sp9m/LGsg LNP处理能显著降低细胞内的HIV-1特异性PCR产物。通过设计引物扩增整合位点两侧的宿主基因组序列，证实了完整的HIV-1-GFP前病毒基因组被成功切除。进一步的数字PCR定量分析，使用靶向HIV-1基因组不同保守区域（如LTR、Ψ包装信号、RRE）的探针，均一致显示经过LNP处理后，细胞内的前病毒DNA拷贝数大幅下降，证明了CRISPR/Cas9编辑的高效性。
3.5. DARPin-LNP spCas9处理显著阻断了J-Lat和2D10潜伏模型中的HIV-1再激活
功能实验表明，经DR-Sp9m/LGsg LNP预处理后，即使用强效的潜伏反转剂SAHA和TNFα刺激，J-Lat 10.6和2D10细胞中由GFP报告基因指示的病毒再激活也被显著抑制。共聚焦显微镜和流式细胞术定量分析均显示，处理组的GFP阳性细胞比例和平均荧光强度均远低于对照组。这证实了前病毒DNA的切除在功能上有效地阻断了病毒的转录再激活。
结论与意义
该研究成功构建并验证了一个模块化、非病毒、受体引导的递送平台——双极性双DARPin修饰的LNP。该平台通过创新的化学偶联策略实现了对CD4 T细胞的高效靶向，并能够共同递送CRISPR/Cas9 mRNA和多靶点sgRNA。在经典的HIV-1潜伏感染细胞模型中的实验证明，该平台能够高效、特异地切除整合的前病毒DNA，并功能性阻断病毒的再激活。
这项工作的意义在于：
- 1.
解决了精准递送的关键难题：通过DARPin介导的靶向，将基因编辑工具精准递送至主要的HIV-1潜伏库细胞（静息CD4 T细胞），提高了治疗的特异性和效率，减少了对非靶细胞的脱靶效应。
- 2.
提供了一个稳定、可扩展的平台技术：改进的LNP配方提供了良好的冷链稳定性，双极性偶联策略确保了靶向分子的正确取向和高效展示。这种模块化设计易于适配其他靶向配体或治疗性载荷。
- 3.
为HIV-1治愈策略提供了新的概念验证：研究证实了基于mRNA的CRISPR/Cas9通过靶向LNP递送，在切除潜伏前病毒和阻断再激活方面的巨大潜力，为开发下一代HIV-1根治性疗法迈出了重要一步。
总之，这项研究将先进的靶向技术（DARPin）、高效的递送载体（LNP）和强大的基因编辑工具（CRISPR/Cas9）有机结合，为攻克HIV-1潜伏储存库这一长期挑战提供了一种极具前景的新策略。
