《Ecology and Evolution》：Perivitelline Membrane-Bound Sperm as a Source of Paternal Genomic DNA to Inform Breeding Male Marine Turtle Genetics and Demographics
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本文介绍了一种创新方法，通过从海龟窝的单个卵中提取卵周膜内陷精子（Perivitelline Membrane, PVM）进行基因分型，以高效、无创地获取成功繁殖的雄性遗传信息。该方法克服了传统通过幼体取样评估多重父系和繁殖性别比的局限性，具有在时空尺度上扩大监测的潜力，为在气候变化背景下评估种群生存力、雄性介导的基因流动和遗传连接性提供了关键数据。
引言
全球气候快速变化对依赖环境决定性别（Environmental Sex Determination, ESD）的物种构成威胁，海龟便是其中之一。海龟的性别由孵化温度决定，较凉爽、湿润的巢穴会产生更多雄性，而较炎热、干燥的巢穴则产生更多雌性。升温趋势可能导致种群“雌性化”，并因繁殖雄性的减少而危及遗传多样性。在佛罗里达、百慕大和澳大利亚雷恩岛等关键栖息地，已观察到海龟种群性别比例向雌性倾斜的长期趋势。这引发了关于海龟交配系统的更广泛问题：维持遗传多样性和确保受精所需的最少雄性数量是多少？雄性的出生地忠实性与扩散行为在不同物种和种群间有何差异？解答这些问题亟需更好的繁殖雄性种群统计数据和空间生态学数据。
目前，通过活体幼龟取样鉴定父本等位基因，已被用于识别窝内的多重父系（Multiple Paternity, MP）和估算繁殖性别比（Breeding Sex Ratio, BSR）。但这种方法在操作上强度很大，需要夜间监控巢穴以等待幼龟出壳，并尝试对每窝取样20只幼龟。其强度限制了在全球范围内对少量筑巢点的研究，且空间和时间上的采样不重叠，阻碍了对更大尺度遗传连接性的推断。因此，需要一种更高效的方法来表征繁殖雄性，以支持更广泛的雄性种群统计和遗传学研究。
方法
野外采样
研究在美国佛罗里达州墨尔本海滩的阿奇卡尔国家野生动物保护区（Archie Carr National Wildlife Refuge, ACNWR）一段2公里长的海滩上进行。研究人员在产卵后的早晨，从27窝蠵龟和13窝绿海龟的巢中各收集一枚卵。为了支持PVM推断并评估雄性的相对贡献，研究还深入采样了活体幼龟、死亡幼龟和胚胎组织。在巢穴孵化约45天后，安装限制笼以捕获夜间出壳的幼龟进行取样。
实验室方法
- 1.
PVM分离：清洗卵壳后，尝试移除胚胎。随后，分离包裹卵黄的卵周膜。在拉伸时，内层PVM形成一个部分不透明、略显黄色的“箭头”状结构，可与外层膜和蛋白区分。剪下并储存经修剪的内层PVM用于DNA提取。卵壳也被储存用于提取母本DNA。
- 2.
DNA提取与基因分型：分别从卵壳和PVM中提取母本和父本DNA。蠵龟样本在16个微卫星位点进行基因分型，绿海龟样本在13个微卫星位点进行基因分型。这些位点经过筛选，在西北大西洋海龟种群中具有高多态性。
数据分析
首先，通过对比卵壳和PVM的电泳图，确认并解析PVM中的等位基因，判断其主要信号是父本、混合（母本/父本）还是胚胎来源。一些PVM基因型是严格的父本型，没有任何母本等位基因。对于表现出混合信号的PVM，通过比较所有位点上PVM和卵壳基因型的信号强度，来评估污染来源是母本还是胚胎。
基于PVM中非母本等位基因的数量，估计了每窝的最少父本数量。例如，在所有位点出现1-2个非母本等位基因，则推断有1个父本；在任何位点出现3-4个，则推断有2个父本，以此类推。对于推断为单父本的窝，研究人员尝试通过比较卵壳和PVM电泳图来直接推断父本基因型。
随后，使用COLONY2软件进行亲本分析和全同胞分析，以基于子代基因型推断父本贡献，并将结果作为“地面实况”来验证PVM推断的准确性。此外，还通过随机子抽样（每窝20个幼龟）模拟，比较了PVM方法与标准20只幼龟取样法在检测贡献较少的父本时的表现。
结果
基因型与PVM信号
基于母本基因型，蠵龟和绿海龟的微卫星面板均显示出极高的个体识别和亲本排除能力。在27枚蠵龟卵中，大部分PVM基因型是严格的父本型或父本信号强于母本/胚胎信号。仅有少数PVM被母本或胚胎DNA“淹没”。在所有13枚绿海龟卵的PVM中，均检测到精子等位基因，且信号为父本型或父本信号更强。子代基因分型质量很高，蠵龟和绿海龟分别检测到至少41名和29名父本。
PVM与子代推断的父本比较
- 1.
父本数量推断：在蠵龟中，排除两个被胚胎DNA淹没的窝后，其余25个窝里有24个的PVM推断父本数量与子代验证结果一致。唯一的例外是Cc032窝，其子代推断出的次要父本未在PVM中检测到。在绿海龟中，13个窝里有11个的PVM推断与子代验证一致。例外情况包括：Cm254窝中一个仅贡献了1只幼龟的父本未被PVM检测到；Cm219窝中PVM推断存在一个子代基因型未验证的父本。
- 2.
次要父本检测：对于贡献了≤11%子代的父本，PVM检测率很高。在蠵龟和绿海龟中，大多数此类父本都被PVM成功识别。随机子抽样分析表明，PVM检测这些次要父本的能力，与每窝采样20只幼龟的传统方法相当甚至略优。
- 3.
等位基因检测：除了少数例外，所有从子代基因型推断出的父本等位基因，均在父本信号占优的PVM中被检测到。在多重父本的窝中，93%的父本等位基因在PVM中被检测到。研究也发现了一些PVM中存在但子代样本中未出现的独特父本等位基因，这些情况通常发生在对应父本贡献的子代数量非常少时。
单父本窝PVM基因型推断的准确性
对于通过PVM基因分型初步推断为单父本、且父本信号占优的窝，研究人员尝试直接从PVM推断父本完整基因型。在蠵龟的此类窝中，高达99%的PVM推断父本等位基因与基于子代重建的父本基因型一致。在绿海龟中，所有推断为单父本的窝，其PVM推断的父本基因型与子代重建结果100%一致。
讨论与意义
本研究成功验证了通过基因分型卵周膜内陷精子来表征海龟繁殖雄性的新方法。该方法能准确推断窝内的父本数量，检测率与采样20只幼龟的传统方法相当，并能从单父本窝中高精度地直接获取父本基因型。
该方法具有显著优势：虽然需要破坏每窝中的一个卵，但对筑巢雌龟和幼龟是无创的，且无需等待和捕捉大量幼龟，极大简化了物流操作。其可扩展性使其能够跨越时空进行长期监测，这对于评估气候变化下的种群生存力至关重要。此外，从单父本窝的PVM中获取的雄性基因型，还可用于种群归属分析、遗传连接性评估和亲缘关系分析，为理解雄性介导的基因流提供了新途径。
尽管存在母本或胚胎DNA淹没、等位基因丢失等技术挑战，但本研究证实，在大多数情况下，PVM基因分型是一种可靠、高效的工具。它有望推动对海龟，乃至其他具有类似生殖结构的物种的繁殖雄性生态学、遗传学和保护生物学研究。
