《Ecosphere》：Long-term leguminous mulch reduces microbial nutrient limitation and enhances soil multifunctionality of citrus orchard
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这篇综述系统评估了豆科绿被覆盖（LGM）对柑橘园土壤微生物代谢限制及生态系统多功能性（EMF）的调控机制。研究通过比较清耕、4年覆盖和8年覆盖三种处理，揭示了长期LGM通过增加土壤碳、氮、磷养分含量和相应酶活性，缓解微生物养分（尤其是C和P）限制，从而显著提升土壤EMF。核心发现强调了表土层和果实膨大期（WFS）是效应最显著的区域和时段，为制定精细化果园管理策略提供了时空依据。
引言
果园作为重要的农业生态系统，在全球水果需求增长的驱动下迅速扩张。然而，集约化的传统耕作模式（如清耕和过度施肥）加速了环境污染和土壤退化，削弱了果园的生态系统功能。活体绿被覆盖，作为一种可持续的土地管理实践，通过增强养分循环、减少土壤侵蚀、抑制杂草和改善果园微生态，成为促进果园可持续性的重要策略。其中，豆科绿被覆盖（LGM）因其共生固氮能力和较低的碳氮比（C:N）而被广泛应用。然而，短期的覆盖效果有限，不同研究因覆盖时长、采样深度和时间点差异而结果不一，关于LGM如何调控果园土壤养分循环及其微生物机制仍不清楚。本研究评估了LGM对亚热带中国柑橘园土壤的影响，旨在阐明：（1）土壤C、N、P含量及相关酶活性的变化；（2）微生物养分限制对覆盖年限（MA）、土壤深度（SD）和生长时期（GP）的响应；（3）驱动LGM下土壤多功能性的机制。
材料与方法
试验地点位于湖北省秭归县，属亚热带季风气候。供试土壤为紫色砂壤土。设三种处理：覆盖光叶紫花苕（VV）8年（VV_8）、覆盖4年（VV_4）和清耕对照（CT）。于2021年柑橘三个生长时期采样：萌芽-春梢期（BSS）、枯萎-果实膨大期（WFS）和播种-果实成熟期（SFM）。采样深度为0-10、10-20和20-40厘米。测定土壤化学性质（总氮TN、总磷TP、土壤有机碳SOC、碱解氮AN、有效磷AP、pH值）和微生物生物量（微生物生物量碳MBC、氮MBN、磷MBP）。测定了与碳（C_acq：β-葡萄糖苷酶BG、纤维二糖水解酶CB、α-葡萄糖苷酶AG、β-木糖苷酶BX）、氮（N_acq：亮氨酸氨基肽酶LAP、N-乙酰葡糖胺糖苷酶NAG）和磷（P_acq：酸性磷酸酶APH）获取相关的酶活性。采用向量分析法评估微生物代谢限制，计算向量长度（C限制）和向量角度（P或N限制）。通过整合酶活性、养分循环变量和微生物生物量指标，采用平均法计算土壤生态系统多功能性（EMF）指数。
结果
土壤生化性质的变化
土壤C、N、P养分、pH和微生物生物量均显著受覆盖年限和土壤深度影响。生长时期显著影响了除SOC和TN外的所有性质。与清耕相比，VV_8处理显著提高了SOC（76.52%–89.29%）、TN（32.50%–88.90%）、AN（49.49%–102.70%）和AP（68.02%–358.87%）。微生物生物量（MBC、MBN、MBP）也大幅增加。VV_4的影响则更为有限，仅在特定土壤深度或生长时期下显著改变土壤生化性质。所有土壤化学性质均随土壤深度增加而下降。
酶活性及化学计量评估
覆盖年限、土壤深度、生长时期及其交互作用显著影响了七种酶的活性。酶活性总体上随土壤深度增加而降低。在整个生长时期中，BG、CB、BX、AG、NAG和LAP活性在WFS期增加，而APH活性则下降。与清耕相比，VV_8处理在不同土壤深度和生长时期均显著增强了酶活性，而VV_4的影响仅限于表层土壤。
就养分循环而言，C_acq、N_acq和P_acq酶活性随覆盖年限增加而增加，随土壤深度增加而降低。C_acq和N_acq酶活性在生长时期中先升后降，而P_acq活性则呈现相反模式。在WFS期，C_acq活性的最大增量是N_acq的12.50倍。VV_8和VV_4均显著增强了WFS期的C_acq活性。LGM下P_acq活性在各生长时期持续增加。
向量分析表明，向量长度显著受覆盖年限、土壤深度、生长时期及其交互作用影响，而向量角度仅受覆盖年限、生长时期及覆盖年限-土壤深度交互作用影响。向量长度在WFS期大于BSS和SFM期，按处理排序为VV_8 < VV_4 < CT，表明碳限制随覆盖年限延长而逐步缓解。具体而言，VV_8使碳限制降低了6.69%–45.02%。相比之下，向量角度在WFS期最低，但仍大于45°，所有酶化学计量坐标均位于1:1线之上，表明持续的磷限制。VV_4在WFS和SFM期加剧了微生物磷限制，而VV_8在0-10厘米土层中使磷限制降低了1.59%–9.47%。向量长度和角度的反向变化证实了两者间存在强烈的负相关。
土壤EMF及其主要影响因素
土壤EMF显著受覆盖年限、土壤深度、生长时期及其交互作用影响。EMF在0-10厘米土层始终高于深层土壤，并按生长时期排序为WFS > SFM > BSS。与VV_4和清耕相比，VV_8显著提高了EMF，尤其是在WFS和SFM期的0-10厘米土层（EMF值 > 2.0）。VV_4在WFS和SFM期也提高了EMF，但仅在0-10厘米土层为正值。相比之下，清耕下的所有EMF值均为负值。因此，LGM显著增强了土壤EMF，且改善程度随覆盖年限增加而加强。
偏最小二乘回归模型对EMF变异的解释率高达99%以上。VIP值大于1的指标的回归系数均为正值，表明对EMF有显著正效应。在所有时期，N_acq、MBC和C_acq分别是ALL、BSS、WFS和SFM期最强的EMF预测因子。P_acq、MBP、AN和TN在所有时期也均有显著效应。
偏最小二乘结构方程模型显示，各变量共同解释了EMF 99%的变异。在整个时期，N_acq和C_acq具有最强的直接正效应。在BSS期，非生物养分库、生物养分库和N_acq具有相当的直接正效应。相比之下，C_acq是WFS期和SFM期的主导驱动因子，其次是非生物养分库和N_acq。
C和N储存主要通过间接途径而非直接途径产生影响。具体而言，N储存直接调控生物和非生物养分库，后者进而直接影响C_acq和N_acq酶活性。N储存的总效应是其直接效应的3.64–5.08倍，表明其对EMF的调控主要通过间接效应实现。在ALL、BSS和SFM阶段，生物养分库表现出最高的总效应，而在WFS阶段，N储存占主导地位。总体而言，EMF主要由C_acq和N_acq酶活性的直接效应以及C和N养分的间接效应共同塑造，且其影响随着生长时期的推进而增强。
讨论
长期LGM下养分有效性得到增强并强烈受生长时期影响
两种VV覆盖处理均提高了相对于清耕的土壤养分含量和微生物生物量，但改善程度因覆盖年限、土壤深度和生长时期而异。这主要归功于VV根瘤的固氮作用，缓解了养分竞争并促进了养分积累。覆盖年限和土壤深度显著影响了所有生化性质。随着覆盖年限延长，土壤有机碳持续增加，反映了VV残体持续的有机质输入。长期LGM提高了养分供应能力。生长时期对碱解氮、有效磷、MBC、MBN和MBP有显著影响，但对SOC和TN无显著影响。季节性变化强烈调节土壤条件，速效养分对温度和降水更为敏感。因此，LGM跨生长时期对速效养分的调控在维持土壤多功能性方面起着关键作用。
长期LGM更有益于促进酶活性并缓解微生物C和P限制
LGM也增强了土壤酶活性。酶活性随覆盖年限增加而增加，但随深度增加而降低。VV_4处理下，酶活性仅在0-20厘米土层增加。相比之下，VV_8处理在所有深度均显著提高了酶活性。酶活性也随生长时期变化。C_acq和N_acq酶在WFS期达到峰值，而P_acq酶活性则呈现相反趋势。这些模式与温度和水分密切相关。C_acq和N_acq酶随温度升高而增加，其中C_acq酶更敏感。相反，P_acq酶对温度响应较弱。采样期间WFS期土壤温度较高但水分较低，较高的温度解释了WFS期较高的C和N酶活性，而水分减少可能抑制了磷酸酶活性。此外，VV枯萎后根系生物量和活性下降，也可能导致P_acq酶活性降低。
向量长度随覆盖年限增加而减小，表明LGM（尤其是长期覆盖）有效缓解了因VV残体分解导致的微生物碳限制。WFS期观察到的碳限制加剧与C_acq酶活性的显著增加有关。随着更多酶被分泌，对碳源的需求加剧，从而放大了碳限制。此外，VV覆盖改善了氮有效性，这进一步增加了微生物维持氮代谢所需的碳需求，有助于解释WFS期碳限制的加剧。向量角度和酶化学计量显示，果园土壤存在磷限制。VV_4处理下向量角度增加，表明覆盖初期磷供应不足加剧了磷限制。果树与VV之间对磷的竞争可能导致养分固持，暂时破坏养分平衡，降低土壤磷有效性。尽管LGM减少了土壤侵蚀，但侵蚀控制所保留的磷不足以抵消覆盖初期根系竞争造成的磷消耗，从而导致短期磷限制。相比之下，VV_8处理下向量角度减小，表明长期覆盖后磷限制得到缓解。这种转变可能归因于积累的VV残体分解增强了有机磷矿化，以及扩大的根系系统通过释放有机酸促进了磷的有效性。WFS期磷限制的减少可能是由于果树与枯萎VV之间的竞争减弱，VV残体将磷返还给土壤。支持这一点的是，WFS期P_acq酶活性的降低表明磷有效性提高。综上所述，这些结果表明LGM缓解了微生物的碳和磷限制，尤其是在长期覆盖下。
土壤EMF对覆盖年限呈积极响应，并受C、N养分及相应酶活性的强烈调控
LGM也增强了土壤EMF。EMF随覆盖年限增加而增加，在VV_8处理下达到最高水平。这种改善反映了长期覆盖下养分有效性的富集，增强了微生物活性和生物化学循环，从而促进了EMF。土壤深度对EMF的影响可能源于不同深度微生物多样性的差异。一些研究报告细菌α多样性随深度增加而降低，因为表土层含有更高的有机质以支持微生物增殖。长期覆盖已被证明可以增强表土层α多样性。在这些条件下增强的微生物代谢进一步加速了EMF。生长时期也产生了强烈影响，反映了微生物组成和活性的季节性变化。土壤微气候的季节性变化（特别是温度升高）被认为是微生物动态的驱动因素。因此，WFS期EMF的显著增加可能是由于较高的土壤温度有利于微生物生长和生物量积累。值得注意的是，C_acq酶活性的模式在整个生长时期与EMF密切相关，凸显了C_acq酶在调控EMF中的主导作用。
EMF指数通过整合酶的底物亲和力和催化效率来捕捉土壤生物多样性功能。在本研究中，与养分循环相关的酶活性与土壤性质密切相关。大多数N、P、C养分以及酶活性与EMF呈正相关，表明其受非生物和生物因素的共同调控。长期LGM显著增加了土壤养分含量。养分富集的微环境可能刺激了微生物多样性和生物量，加速了酶分泌，并创造了微生物热点，增强了养分循环和有机质分解，从而加强了EMF。PLS-SEM分析表明，生物养分库和N储存对EMF具有最强的总效应，而C_acq和N_acq酶活性是主要的直接驱动因子。N储存反映了土壤供应速效氮的能力，直接影响生物和非生物养分库。LGM下C和N有效性的提高有益于不同的微生物类群，加速了生物地球化学循环，并进一步促进了EMF。然而，与一些研究不同，本研究发现酶活性（特别是WFS期的C_acq）对EMF的直接效应强于其他因素，强调了碳固定和释放在生物过程中的核心作用。先前的研究同样强调了酶活性的直接作用。阐明这些微生物调控机制对于理解土壤指标在LGM下如何支配EMF至关重要。未来的研究应采用长期、多尺度的实验设计，并结合微生物群落分析，以进一步阐明LGM调节EMF的机制通路。
本研究探讨了豆科覆盖对土壤微生物代谢限制和EMF的影响，为了解果园土壤多种生态功能下的微生物调控机制提供了宝贵见解。然而，研究范围仅限于单一覆盖类型，从而限制了其调控潜力。近年来的研究越来越强调混合绿被覆盖对作物产量和养分利用效率的优越效应。混合覆盖贡献了更大的土壤C和N输入，显著提高了富营养型微生物的丰度。这反过来平衡了微生物群落间的养分循环和资源竞争，提高了资源利用效率，并对土壤EMF产生了更强的积极效应。尽管如此，鉴于土壤生态系统的复杂性和覆盖类型的功能异质性，种间混合并不总是起到互补作用。因此，确定混合覆盖的最佳间作模式仍然是未来研究的一个挑战和优先事项，对果园管理具有直接的实际意义。尽管我们之前的工作分析了活体绿被覆盖下细菌和真菌群落组成和多样性的变化，但这些发现也仅限于豆科覆盖。未来的研究应阐明混合覆盖如何调控微生物群落组装和多样性以影响EMF，最好结合长期的田间监测。这些努力将为选择和组合草种以支持果园最佳管理实践提供科学基础。
结论
在本研究中，与清耕相比，VV_8和VV_4处理增强了土壤生化性质和酶活性。这些改善随覆盖年限增加而增加，但随土壤深度增加而下降，并且在WFS和SFM期比BSS期更为显著。与清耕相比，VV_8处理在所有生长时期将C_acq、N_acq和P_acq相关的酶活性分别提高了0.44–3.60倍、7.76–26.58倍和1.56–5.61倍。此外，VV_8处理在所有深度缓解了微生物碳限制（降低6.69%–45.02%），并在0-10厘米土层缓解了磷限制（降低1.59%–9.47%），从而提升了土壤EMF。PLSR和PLS-SEM分析均表明C和N养分及其相应酶活性对EMF有促进作用。PLS-SEM还揭示，EMF直接受C_acq和N_acq酶活性影响，间接受土壤C和N有效性影响。其中，C_acq酶活性在WFS期对EMF具有最强的协同效应。总体而言，长期覆盖缓解了微生物的碳和磷限制，改善了EMF，其效应在表土层和WFS期最为明显。这些发现为制定精细化和有针对性的果园管理策略提供了框架，强调了LGM如何在时空梯度上调节土壤养分供应和循环能力。
