《Microchemical Journal》：A rigorous UHPLC-HRMS untargeted workflow for bipolar disorder metabolic fingerprinting
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本研究通过UHPLC-HRMS分析发现，双相情感障碍（BD）患者与健康人尿液代谢指纹存在显著差异，采用严格质控和过滤流程后，鉴别准确率超过90%，为客观诊断工具的开发奠定基础。
Sara Tanilli | Maria Loreta Mazzagatti | Rosangela Santalucia | Matteo Chiarello | Giovanni Solarino | Marco Pazzi | Alessandra Olarini | Marta Massano | Paolo Garofano | Anna Bellicanta | Gabriele Lando | Marco Vincenti | Eugenio Alladio
意大利都灵大学化学系
摘要
背景
双相情感障碍（BD）是一种复杂的精神疾病，其特征是躁狂和抑郁发作交替出现。诊断完全依赖于临床评估，但由于症状重叠，经常导致与其他精神疾病的误诊。这种诊断不确定性需要开发基于实验室的客观工具来补充临床评估。缺乏可靠的生物标志物是一个关键问题，阻碍了准确诊断和及时治疗干预。本研究旨在通过尿液代谢组学分析，寻找能够区分BD患者和健康个体的客观代谢特征。
结果
采用超高效液相色谱与高分辨率质谱联用技术（UHPLC-HRMS）对20名BD患者和20名健康对照组的尿液样本进行了分析，同时使用了正离子化和负离子化模式。通过严格的非靶向代谢组学分析流程（包括空白样本、内标和混合质量控制样本），确保了数据质量和分析过程的可重复性。利用Compound Discoverer? v3.3软件提取并注释了代谢特征，并实施了结构化的过滤流程以处理高维数据和潜在的药物干预干扰。探索性主成分分析显示了明显的组间差异，而偏最小二乘判别分析的准确率超过了90%，成功区分了BD患者和健康对照组。
意义
本研究证明，特征性的尿液代谢指纹可以高精度地区分BD患者和健康个体。经过验证的分析和化学计量学工作流程为开发基于实验室的客观诊断工具奠定了基础，这些工具可以补充临床评估，可能降低误诊率。这些发现是将代谢组学研究转化为精神疾病临床应用生物标志物策略的重要一步。
引言
双相情感障碍（BD）是一种以躁狂和抑郁交替发作为特征的精神疾病[1]。根据世界卫生组织的数据，它是全球第六大致残原因[2]，与高自杀风险（约30-50%）和预期寿命缩短相关[1]。BD的诊断具有挑战性，因为它仅依赖于症状和患者病史的临床评估。由于症状重叠，BD常被误诊为重度抑郁症（MDD）或精神分裂症[1]。诊断不当的个体平均要等待超过七年才能得到正确的诊断[3]。因此，迫切需要基于实验室的客观诊断工具来支持更准确的诊断。
基因组学、转录组学和神经影像学研究显著推进了我们对BD的科学理解[4]。尽管BD具有高度遗传性（80-90%），但对同卵双胞胎的研究也强调了环境和生活方式因素在其发病中的重要性[3]。作为组学科学中最下游的领域，代谢组学整合了遗传和环境因素的影响，其在精神病学领域的应用在过去十年中得到了显著发展。靶向和非靶向代谢组学方法均被用于BD研究，以发现新的生物标志物[5]。与非靶向研究关注预先选定的代谢物不同，非靶向代谢组学是一种探索性的“自由假设驱动”方法，可以提供生物体代谢状态的全面概览。它主要用于“代谢指纹”分析，以识别与特定生理或病理条件相关的特征性代谢模式[5]。
高分辨率质谱（HRMS）与液相色谱联用是进行非靶向代谢组学分析的首选平台，因其具有高灵敏度和分辨率[6]。尽管脑脊液（CSF）能最准确地反映中枢神经系统的变化，但其采集具有侵入性，限制了其临床应用。血液（血浆或血清）常作为替代样本，大多数研究都集中在这一样本上，而尿液虽然采集非侵入性，但受到的关注较少[5]。多项代谢组学研究发现BD患者存在氨基酸[7]、能量[2]、脂质[10]、嘌呤代谢途径[9][12]等的紊乱[7][8][9][11]。尽管这些发现很有前景，但有时存在不一致性，表明该领域需要进一步研究[5]。
这些研究中的一个关键挑战是BD药物治疗的干扰效应。大多数BD患者接受个性化药物治疗，常见药物包括锂盐、丙戊酸和喹硫平，通常与其他药物联合使用[14]。尽管这些药物的具体代谢效应尚未完全明了[15]，但已知药物使用会显著改变个体的代谢组。这种差异性增加了识别疾病特异性代谢特征的动力学复杂性。许多研究承认这一限制，影响了结果的普遍性[11][12]。
在这种新兴且具有挑战性的背景下，我们开发并应用了一种严格的非靶向代谢组学分析流程，以识别BD的尿液“代谢指纹”。通过质量保证（QA）和质量控制（QC）程序确保了数据质量[16]。实施了一种稳健、结构化的特征过滤流程，仅保留生物学上有意义和统计上显著的代谢特征，并在Compound Discoverer?数据预处理后应用。该流程还包括考虑BD药物治疗干扰效应的策略，从而去除了多余的假生物标志物。我们的案例/对照研究证明了该流程的有效性，多变量统计分析也证实了BD的可靠尿液代谢特征。这项工作为BD尿液代谢组提供了新的见解，并为其他受外部因素（如药物使用）影响的非靶向代谢组学研究提供了可行的框架。
研究队列
研究队列包括20名BD患者和20名健康对照组（HC）。BD患者来自意大利都灵Trofarello的“emeis - Casa di Cura Villa di Salute”精神病诊所。HC参与者作为志愿者招募，并通过Hirschfield等人（2000年）开发的验证问卷进行BD风险筛查[17]。HC的排除标准包括当前使用抗抑郁药、抗精神病药或情绪稳定剂。
数据预处理和过滤流程
在确认两种离子化模式的重复性后，进行了CD数据预处理。通过监测氘代内标的重复性（补充材料，图S3）和评估QC重复样本的聚类（补充材料，图S4），确认了批内重复性。尽管原始数据已经显示出良好的QC聚类效果，但使用SERRF校正后的数据获得了更紧密的聚类。
讨论
非靶向代谢组学在代谢指纹分析和新生物标志物发现中的应用显著增加。过去十年中，采用这种方法研究神经精神障碍的兴趣日益浓厚。基因组学和转录组学分析提高了对BD的理解；然而，它们无法捕捉所有由外部因素引起的生化过程。非靶向代谢组学为这一领域提供了新的研究方向。
结论
本研究提出了一种方法严谨且可重复的非靶向代谢组学分析流程。所提出的过滤策略结合了多种QC指标，解决了多重检验问题，并处理了BD治疗的干扰效应，这是对以往研究的重大改进。从数据采集到预处理和统计建模的保守方法确保了只保留最稳健和生物学上有意义的代谢特征。
CRediT作者贡献声明
：数据整理、方法学、初稿撰写。
：方法学、数据整理。
：正式分析。
：正式分析。
：数据整理。
：正式分析。
：概念化。
：概念化、资金获取。
：概念化、方法学。
：概念化、资金获取。
资助
本研究得到了NODES PREDIBIO项目（https://ecs-nodes.eu/5-industria-della-salute-e-silver-economy/progetti-imprese/predibio 利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢MUR计划“Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027”下的CH4.0项目（CUP: D13C22003520001）的支持。
