用于检测GHRP-6的比率计量型分子印迹电化学传感器

《Microchemical Journal》：Ratiometric molecularly imprinted electrochemical sensor for the detection of GHRP-6

GHRP-6检测中基于分子印迹与离子液体的双信号电化学传感器研究，实现1.0 pg/mL超低检测限，抗基质干扰能力强，稳定性优异。

　　

作者：曹玉萌、高欣、詹月、段梦涛、杨莫林、胡蓓蓓、李中秋、李志伟

河北科技大学化学与制药工程学院，中国石家庄市玉祥路26号，邮编050018

摘要

生长激素释放肽-6（GHRP-6）是一种具有强效生长激素分泌促进活性的多肽，在医学研究和运动科学中有着广泛的应用。然而，非法使用和滥用的问题日益严重，这凸显出对高效、灵敏检测方法的迫切需求。为了解决GHRP-6的微量检测难题，本研究结合分子印迹技术（MIT）与电化学传感技术，构建了一种比率电化学传感器MIP/[APMIm]Br/CS@MWCNTs/GCE。利用硫辛酸（Thi）作为内部参考信号，[APMIm]Br离子液体作为功能修饰剂，建立了双信号转导机制。通过双信号比值（I_Fe/I_Thi）来消除基质环境干扰，该传感器在0.3–80 ng/mL的线性范围内实现了低至1.0 pg/mL的检测限。值得注意的是，在存在100倍浓度干扰物的情况下，其回收率为98.1%–104.6%，重复性RSD为2.04%，且30天后信号衰减仅为6.4%。这些性能参数相比传统检测技术有了显著提升，为GHRP-6的微量分析提供了一个可靠的平台。

引言

生长激素释放肽（GHRPs）是一类能够强烈刺激生长激素（GH）分泌的人工合成小分子多肽[1]，在调节身体生长、发育和代谢等生理过程中起着关键作用[2]。由于GHRP-6在调节GH分泌中的重要作用以及在体育和医学领域的潜在滥用风险，对其实现高灵敏度、高特异性和快速检测是一个挑战[3]。传统的GHRP-6检测技术，如液相色谱-质谱（LC-MS）和超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS），在一定程度上能够对其进行定量分析。例如，一种针对尿液中多种GHRPs的高通量LC-MS/MS方法实现了5–1000 pg/mL的宽线性范围和低至5–25 pg/mL的检测限（LOD），显示出对尿液基质中这类化合物的高灵敏度[4]；同样，一种专门用于复杂生物基质中GHRP-6的UHPLC-MS/MS方法在纯溶液、血浆和微针聚合物溶液中测得的线性范围为0.3–60 ng/mL，在皮肤中的LOD分别为0.1 ng/mL、1.1 ng/mL和1.5 ng/mL[5]。尽管在灵敏度和线性范围方面取得了进展，但这些技术在实际应用中仍存在诸多局限性。

分子印迹技术（MIT）能够模拟抗体-抗原或酶-底物之间的特异性结合，使聚合物基质内部形成与目标分子形状和功能互补的空间结构[6]。分子印迹聚合物（MIP）可以根据目标分子的三维结构进行识别，从而兼具选择性和稳定性[7]。该技术已应用于小分子化合物[8]、蛋白质[9]等物质的检测[10]。当MIP与电化学传感器结合时，可以提高目标分析物的灵敏度和选择性[11]。羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs）是一种常用的电极修饰材料[12]，可以增强电极表面的电子转移速率[13]；与MIP结合后，MWCNTs能提供更大的比表面积和更多的结合位点，从而提高分子印迹电化学传感器（MIP-ECSs）的灵敏度[14]。

离子液体（ILs）因其优异的电导率、稳定性和宽电位窗口而在电化学和电分析领域得到广泛应用[15]。在构建MIP-ECSs时，ILs不仅作为电极修饰剂改善电极性能，还充当电解质[17]、功能单体[18]和掺杂剂[19]的角色。作为电极修饰剂，ILs可以提升材料的导电性、分散性、亲水性和电催化性能[20]，从而改善MIP-ECSs的分析性能[21]。Xia等人[22]制备了一种用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BMIMPF₆）和壳聚糖-石墨烯改性的纳米复合材料，结果表明BMIMPF₆提高了石墨烯的分散性和导电性，为MIP的制备提供了较大的比表面积和丰富的结合位点，并增强了MIP-ECS的电化学响应灵敏度，成功应用于牛血清白蛋白（BSA）的检测。

比率电化学传感器能够产生两种不同的电化学信号[23]：一种来自目标分子，另一种来自内部参考物质或通过不同的电化学机制产生[24]。通过比较和分析这两种信号的变化，可以有效减少环境因素和样品基质的干扰[25]，显著提高检测的准确性和可靠性[26]。引入参考信号是比率传感器设计的关键步骤。目前最常见的引入参考信号的方法是在电极表面负载具有稳定电化学活性的物质，如二茂铁[27]、硫辛酸（Thi）[28]、亚甲蓝（MB）[29]等。这些物质在电化学检测中表现出高度可逆的氧化还原反应，提供稳定的内部参考信号，有效消除环境因素和基质干扰对检测结果的影响[30]。例如，Liu等人[31]构建了一种以MB为内部信号分子的DMMIP/Pt/Co3O4/GCE分子印迹传感器，实现了氯丙嗪盐酸盐的灵敏检测；Yang等人[32]将多柔比星（一种药物活性分子）整合到电极修饰材料中，制备了用于生物样品中尿酸检测的UOx@MOF/BNSs-DOX/GCE传感器。

为了进一步说明比率传感器的优势，本文比较了典型单信号和比率电化学传感器对多种分析物的检测性能。单信号传感器（如用于检测17β-雌二醇[LOD: 3.33 × 10^?10 M, RSD: 3.7%][33]、皮质醇[LOD: 7.2 × 10^?10 M][34]、卡那霉素[LOD: 3.3 × 10^?11 M][35]和多巴胺[LOD: 4.25 × 10^?8 M][36]）通常表现出良好的灵敏度，但其信号容易受到环境因素的影响，有些传感器在一周后检测灵敏度下降约9%[33]。相比之下，比率传感器表现出更高的鲁棒性：不仅灵敏度更优，长期稳定性和测量重复性也显著提高，例如帕图林[LOD: 3.5 × 10^?11 M, 连续测量RSD为1.5%][37]、环丙沙星[LOD: 3.8 × 10^?11 M, 45天后信号下降4.6%][38]、牛血清白蛋白[LOD: 1.1 × 10^?17 M, 7天后信号下降4.8%][39]和17β-雌二醇[LOD: 6.9 × 10^?12 M, 30天后信号下降7.1%][40]。这一对比分析证实了比率策略能有效抑制背景干扰和仪器波动，实现更可靠的检测结果。

在本研究中，使用壳聚糖改性的羧基化多壁碳纳米管（CS@MWCNTs）修饰裸玻璃碳电极（GCE），再通过离子液体1-氨基丙基-3-甲基咪唑溴化物（[APMIm]Br）进行修饰，以促进电子转移过程，从而提高传感器的响应速度和灵敏度（图1）。[APMIm]Br与CS@MWCNTs材料协同作用，增强了材料间的相互作用和稳定性，为目标分子的吸附和扩散提供了更有利的条件。在该传感器系统中，除了MIP与GHRP-6的特异性结合产生的电化学信号变化外，还引入了硫辛酸（Thi）作为内部参考信号分子。通过准确测量和分析两种信号的变化比例，可以有效消除环境因素的干扰，从而获得更准确可靠的GHRP-6浓度信息，显示出在生物分子检测领域的巨大应用潜力。

材料

氯化钾（KCl）、硝酸钾（KNO₃）、氰铁酸钾（K₃[Fe(CN)₆]和氰亚铁酸钾（K₄[Fe(CN)₆）购自天津永大化学试剂有限公司（中国天津）。壳聚糖（CS）来自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs）由江苏先锋纳米材料科技有限公司提供。

开/关比率检测策略的可行性

通过比较两种常用氧化还原探针[Fe(CN)₆^3?/4-和[Ru(NH₃)⁶²⁺在MIP/[APMIm]Br/CS@MWCNTs/GCE电极上的电化学响应，评估了开/关比率检测方法对GHRP-6检测的适用性。在相同条件下进行扫描伏安法（SWV），监测GHRP-6重新结合前后的电流变化（ΔI）。如图2A和B所示，[Fe(CN)₆^3?/4-表现出更高的电流强度和更明显的ΔI值。

结论

本研究结合了离子液体的导电性和硫辛酸（Thi）的内部参考特性，克服了单信号检测的局限性。通过引入硫辛酸作为内部参考信号和离子液体[APMIm]Br，构建了一种比率传感器（MIP/[APMIm]Br/CS@MWCNTs/GCE）。双信号比值（I_Fe/I_Thi）有效消除了基质干扰，实现了低至1.0 pg/mL的检测限和0.3–80 ng/mL的线性范围。

CRediT作者贡献声明

曹玉萌：撰写——原始草稿、软件开发、概念构思。高欣：撰写——原始草稿、数据可视化、方法设计、实验研究。詹月：方法设计。段梦涛：数据分析。杨莫林：验证实验。胡蓓蓓：撰写与编辑、实验监督、资源协调、项目管理、资金申请、概念构思。李中秋：资源协调、资金申请。李志伟：数据验证、数据管理。

知情同意声明

不适用。

机构审查委员会声明

不适用。

资助信息

本研究得到了河北省自然科学基金（项目编号：H2025208002）、河北省卫生健康厅青年科技项目（项目编号：20241758）、河北省科技创新计划（项目编号：22567607H）以及河北省制药与化学工程研究中心（项目编号：225676121H）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。