《Microchemical Journal》：A core-shell quantum dots-based lateral flow strips for sensitive detection of
Escherichia coli O157:H7 and
Listeria monocytogenes combined with RPA and Cas12a
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基于RPA-Cas12a-LFA的食品致病菌可视化快速检测方法研究，建立了同时检测E. coli O157:H7和Listeria monocytogenes的集成平台，vLOD分别为29.0 fg/μL和25.1 fg/μL，检测限达223 CFU/mL和19.5 CFU/mL，并验证了在真实食品样本中的适用性。
曾海娟|李幽|周晓武|刘华|宋杰|朱乐梅|刘娟|冰萍萍|王金斌
上海农业科学院生物技术研究所，农业遗传与育种重点实验室，上海农业生物安全评估与检测专业技术服务平台，中国上海201106
摘要
大肠杆菌 O157:H7和单核细胞增生李斯特菌（大肠杆菌 O157:H7和LM）作为常见的食源性病原体，感染后可引发多种疾病。早期和准确的检测在食品安全和人类健康中起着关键作用。本研究构建了一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统以及自主研发的CdSe/ZnS核壳量子点（QDs）试纸的可视化检测平台，用于检测大肠杆菌 O157:H7和LM，该平台称为RPA-Cas12a-LFA。对于目标DNA，大肠杆菌 O157:H7和LM的检测限（vLODs）分别为29.0 fg/μL和25.1 fg/μL；对于目标细菌，大肠杆菌 O157:H7和LM的检测限（vLODs）分别为223 CFU/mL和19.5 CFU/mL。定量限（LOQs）分别为2.93 fg/μL和2.62 fg/μL（针对DNA）以及2.26 CFU/mL和2.03 CFU/mL（针对细菌）。此外，该方法表现出优异的特异性，且未与其他非目标细菌发生交叉反应。所提出的RPA-CRISPR-LFA成功应用于实际食品样本的直接检测，表明其在现场应用中具有巨大潜力。
引言
食源性病原菌是导致严重传染病（包括呕吐、腹泻、肺炎、败血症和细菌性痢疾）的主要原因，因此对人类健康和食品安全构成重大挑战。[1] 特别是大肠杆菌 O157:H7（大肠杆菌 O157:H7）和单核细胞增生李斯特菌（LM），它们是广泛存在于环境中的主要食源性病原体，能够引发严重疾病。因此，准确及时地检测这些病原体对于有效预防疾病和控制疫情至关重要。微生物平板培养法被认为是细菌鉴定的金标准，但由于需要较长的培养时间（24–72小时），不适合快速和便携式的检测[2]。一些分子检测方法，如聚合酶链反应（PCR）、实时PCR和DNA测序已被用于微生物鉴定[3]，但这些技术需要专业环境、昂贵设备，并且对即时检测（POCT）应用存在挑战。因此，开发一种快速、灵敏且简单的食源性病原体检测方法对于食品安全监测至关重要。
重组酶聚合酶扩增（RPA）能够在温和温度（37–42°C）或室温下实现核酸的等温扩增。整个反应过程迅速，通常在10分钟内即可产生可检测的扩增产物，非常适合POCT检测[4]。侧向流动分析（LFA）是现场病原体检测中最常用的方法之一，因其速度快、操作简单、成本低、结果可视化且用户友好而受到重视[5]。目前也有相关报道指出，通过将RPA扩增的目标序列与侧向流动试纸结合，可以可视化检测食源性病原菌[6]。然而，对于阴性样本，引物二聚体会在试纸上产生假阳性条带，增加了结果解读的难度。
CRISPR-Cas系统是一类能够精确切割DNA或RNA的RNA引导核酸酶，是细菌适应性免疫的重要组成部分[7]。CRISPR-Cas12a的转切割活性能够在识别目标后非特异性地降解单链核酸报告分子，这为其开发高灵敏度核酸检测平台提供了重要基础[8]。研究表明，RPA技术与CRISPR/Cas12a的DNA目标识别和切割特性相结合，可以实现超灵敏的检测。同时，由于其信号转换功能，CRISPR/Cas12a可以引入RPA-LFA系统中，以消除阴性样本的假阳性条带。此外，RPA-CRISPR/Cas系统与其他技术（如微流控平台）结合，也被用于病毒、病原菌等的快速并行检测[9],[10]。
通常，基于胶体金（AuNPs）作为信号探针的免疫层析试纸在灵敏度和非特异性结合问题方面有待改进[11],[12]。如今，各种纳米材料引导的LFA被广泛用于快速、灵敏和现场检测多种生物目标。例如，已有报道将RPA-CRISPR/Cas与AuNPs或彩色微球结合的试纸用于快速、可视化和现场检测转基因作物或食源性病原体[13],[14]。值得注意的是，量子点（QDs）作为示踪剂具有高荧光量子产率和抗光降解能力等优点[15]，可以提高LFA的灵敏度，并具有实际应用的强大潜力。目前，尚未有基于RPA、CRISPR-Cas12a与QDs标记的LFA结合的双目标灵敏可视化检测方法的报道。
本研究建立了一种快速的RPA-CRISPR-LFA平台，用于同时检测大肠杆菌 O157:H7（通过rfbE基因）和LM（通过hly基因）。通过羧基-氨基反应合成了稳定的荧光探针（CdSe/ZnS核壳QDs标记抗体）。在该系统中，RPA用于目标基因的预扩增，CRISPR-LbaCas12a用于信号转导，LFA用于快速、灵敏和现场检测各种生物目标。整个检测过程可在50分钟内完成。RPA-CRISPR-LFA平台成功验证了其对大肠杆菌 O157:H7和LM的同时现场检测能力，在添加了目标菌的食品基质和不同市场购买的过期样本中均表现出可靠的检测效果。值得注意的是，该方法具有良好的线性相关性和可量化潜力。总之，我们的检测平台有助于快速检测食品中的大肠杆菌 O157:H7和LM，从而为食源性疫情的早期干预提供了有效工具。
材料与试剂
引物、报告分子（双标记的单链DNA探针）和crRNA分别由Sangon（中国上海）合成。TIANamp Bacteria DNA Kit型号DP302、RPA检测试剂盒、LbCas12a核酸酶和RNase抑制剂分别从Tiangen（中国北京）、TwistDx（美国马萨诸塞州剑桥）、Tolo Biotech（中国上海）和BBI（中国上海）购买。r-链霉亲和素（r-SA）、牛血清白蛋白（BSA）、山羊抗小鼠IgG抗体（IgGm）和山羊抗兔IgG抗体
基于QDs的RPA-Cas12a-LFA同时检测大肠杆菌 O157:H7和LM的原理
如图1A所示，RPA-CRISPR-LFA系统由三个主要部分组成：RPA扩增、CRISPR-Cas12a切割反应和试纸检测。两种类型的基于QDs的探针如图1B所示设计。羧基化的QDs标记的抗地高辛抗体用于大肠杆菌 O157:H7检测，胺化的QDs标记的抗FITC抗体用于LM检测。简而言之，地高辛/FITC抗体和QDs通过缩合反应进行标记
结论与讨论
为了全面评估本研究中提出的基于QDs的RPA-Cas12a-LFA方法，表1展示了多种病原菌检测方法。基于PCR的方法（编号1–2）具有较高的准确性，但耗时较长，需要熟练的操作人员和精密仪器。用于抗原检测的LFA（编号3–4）具有检测时间短、结果可见和操作简单的优点，但灵敏度相对较低。尽管RPA-LFA方法（编号5–8）具有较好的检测效果
CRediT作者贡献声明
曾海娟：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计、数据管理、概念构思。李幽：撰写 – 原始草稿、可视化处理、实验设计、数据管理。周晓武：方法学设计、实验实施。刘华：验证、数据分析。宋杰：验证、数据分析。朱乐梅：资源获取、实验实施。刘娟：验证、实验实施。冰萍萍：撰写 – 审稿与编辑、监督、实验实施、资金筹集。王金斌：项目整体协调
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了上海 Rising-Star 计划（编号23QB1403500）、SAAS人才项目（2026-2028年）、上海农业生物安全评估与检测专业技术服务平台（编号23DZ2290700）、上海农业应用技术研发计划（编号I2024004）、湖南省教育厅基金（编号24A0683、25A0803）的支持。
