《Molecular Aspects of Medicine》：CRISPR as a therapeutic tool for inherited retinal degenerations: Advances, challenges, and future directions
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CRISPR基因编辑技术为遗传性视网膜疾病（IRDs）提供了多策略治疗，包括基因敲除、碱基编辑、Prime编辑和表观遗传调控，显著改善疾病模型中的视网膜结构和视力。临床首例CEP290相关Leber先天性 amaurosis患者试验取得进展，但仍需解决递送效率、免疫反应和脱靶效应等挑战。
Egle Galdikaite-Braziene | Raulas Kru?nauskas | Emiline Henderson | Kinga M. Bujakowska
眼科基因组学研究所，马萨诸塞州眼耳医院眼科系，243 Charles St，波士顿，MA 02114，美国
摘要
遗传性视网膜疾病（IRDs）是一组遗传多样性的疾病，其特征是感光细胞逐渐退化，最终导致视力丧失和失明。由于涉及超过320个相关基因以及显著的表型变异，有效的治疗仍然具有挑战性。最近在基因组编辑方面的进展，特别是基于CRISPR/Cas的技术，通过实现精确和可定制的DNA和RNA编辑，彻底改变了治疗方法。本文探讨了各种CRISPR策略在IRDs临床前模型中的应用，例如通过非同源末端连接（NHEJ）进行基因敲除、使用双sgRNAs进行外显子跳跃、同源定向修复（HDR）、碱基编辑（BE）、引导编辑（PE）、使用Cas13进行RNA编辑以及通过CRISPRa/i进行表观遗传调控。重点介绍了针对等位基因的特异性方法、不受基因类型限制的方法以及应对显性和隐性疾病形式的策略。我们还强调了最近的临床里程碑，包括首次使用CRISPR基因编辑治疗与CEP290相关的Leber先天性黑蒙症的人体试验。最后，讨论了关键挑战，如递送限制、免疫反应和脱靶效应，以及新兴的解决方案，如工程化的Cas变体、分裂intein系统和先进的脱靶检测方法。这些进展共同凸显了CRISPR技术在治疗IRDs方面的变革潜力，并为未来的临床转化奠定了基础。
引言
IRDs是一组遗传性疾病，其特征是视网膜中的感光细胞逐渐退化，最终导致严重的视力损害甚至失明（Georgiou等人，2021；Hartong等人，2006）。IRDs的遗传基础非常多样，已有超过320个基因（RetNet.org，2025）与各种形式的疾病相关，包括常见的疾病如杆锥细胞营养不良（RCD，也称为视网膜色素变性RP）、Leber先天性黑蒙症（LCA）、Stargardt病和Usher综合征。这些疾病的全球患病率估计约为每3500人中有1例，其中某些类型的IRDs（如RCD）影响全球多达150万人（Bessant等人，2001；Sahel等人，2015）。RCD的发病通常始于杆状感光细胞功能障碍，首先导致夜盲，随后是锥状感光细胞退化，最终丧失中央视觉和色觉（Hartong等人，2006；Verbakel等人，2018）。IRDs的发病年龄差异很大，有些人从儿童早期就出现症状，而另一些人则可能保持功能性视力直到中年甚至更久（Georgiou等人，2021）。
除了FDA批准的用于RPE65相关IRDs的基因疗法Luxturna（Maguire等人，2008，2021；Russell等人，2017）外，目前尚无其他IRDs的治疗方法获得批准。针对这类疾病的研究方法包括不受基因类型限制的策略，如通过药物调节共同的疾病机制（Birch等人，2013；Das和Imanishi，2022；Iraha等人，2016；Komeima等人，2006）；光遗传学（Berry等人，2019；De等人，2022；Ferrari等人，2020；García-Ayuso等人，2022；McClements等人，2020；Nikonov等人，2022；Parnami和Bhattacharyya，2023；Pobo?y等人，2025；Prosseda等人，2022）；视网膜假体（Francia等人，2022；Lin等人，2015；Maya-Vetencourt等人，2017；Petoe和Shivdasani，2016；Weitz等人，2015；Wu等人，2023）；以及使用干细胞衍生的感光细胞前体或视网膜色素上皮（RPE）的细胞疗法（Chen等人，2023；Sanie-Jahromi和Nowroozzadeh，2022）。基于基因或突变的疗法旨在纠正疾病的根本分子原因，基因补充疗法已成为治疗隐性遗传疾病（包括IRDs）的有希望的选择（Blaese等人，1995；Cehajic-Kapetanovic等人，2020；Fischer等人，2020；MacLaren等人，2014；Maguire等人，2008）。其他方法包括使用锌指抑制剂（Caia等人，2014；Mussolino等人，2011）或合成DNA结合蛋白（Botta等人，2016）进行基因沉默；基于RNA的方法，如反义寡核苷酸（AONs），可用于纠正剪接缺陷（如外显子跳跃或隐匿外显子包含（Kaltak等人，2023）；RNA干扰（Millington-Ward等人，2011）；核酶（Cideciyan等人，2018；Gorbatyuk等人，2007）；以及快速发展的基于CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的基因组编辑领域（Barrangou等人，2007；Jinek等人，2012；Sapranauskas等人，2011）。
基于CRISPR的基因组编辑引入了一种新的范式，能够精确操作内源性基因组序列。许多CRISPR应用的一个基本概念是，由Cas核酸酶产生的双链断裂主要通过非同源末端连接（NHEJ）进行修复（Cong等人，2013；Mali等人，2013），这一过程容易出错，可能会导致插入或缺失（indels）。这些indels经常改变开放阅读框（ORF），引入过早的终止密码子，并有效地敲除目标等位基因——这对于显性IRDs形式是一个有益的策略。长期的安全问题促使人们开发了自我限制的载体系统，以暂时表达CRISPR编辑器，从而减少长期的基因组暴露并降低脱靶风险（Ruan等人，2017）。进一步的发展通过使用修复模板或引导编辑和碱基编辑实现了精确的基因组编辑（Anzalone等人，2019；Komor等人，2016；Nakade等人，2014）。本文重点介绍了基于CRISPR的技术如何提高IRDs基因治疗的精确度，使得以前被认为无法治疗的突变得以纠正。
CRISPR基础基因组编辑策略
CRISPR/Cas9是一种精确的基因组编辑工具，可以对生物体的基因组DNA进行靶向修改。最初作为细菌适应性免疫反应的一部分被发现，CRISPR利用两种RNA分子引导CRISPR相关的内切酶（Cas）来靶向并切割入侵的核酸（例如噬菌体DNA），在特定位置诱导双链断裂，这些位置与引导RNA（gRNA）和相邻的原间隔序列（PAM）基序互补（Barrangou等人）。
遗传性视网膜疾病的碱基编辑
碱基编辑器（BEs）能够在不引入双链DNA断裂或依赖HDR的情况下实现精确的单核苷酸变化，使其非常适合编辑有丝分裂后的细胞，如感光细胞（Gaudelli等人，2017；Komor等人，2016）。主要的碱基编辑器分为两类：胞嘧啶碱基编辑器（CBEs），将C转换为T碱基对；腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），将A转换为G碱基对（图2）。这些编辑器结合了Cas9核酸酶（nCas9）和脱氨酶，从而实现...
引导编辑在遗传性视网膜疾病中的应用
引导编辑（PE）是一种精确的基因组编辑方法，可以在不引入双链DNA断裂或需要供体模板的情况下实现靶向的碱基替换、插入和删除（Anzalone等人，2019）。它使用nCas9和逆转录酶（RT）的融合体，由引导RNA（pegRNA）引导。pegRNA不仅将复合体导向正确的位置，还携带所需的基因变化模板。PE可能适用于大约89%的已知...
CRISPR-Cas13 RNA编辑
虽然大多数针对IRDs的基因编辑策略都集中在DNA上，但像CRISPR/Cas13这样的RNA靶向酶提供了一个有前景且可逆的替代方案（Abudayyeh等人，2016，2017；Cox等人，2017；Knott和Doudna，2018）。Cas13属于第2类VI型CRISPR酶，它使用CRISPR RNA（crRNA）来引导其切割互补的单链RNA（ssRNA）（Abudayyeh等人，2016，2017；Knott和Doudna，2018；Zhang等人，2018）（图4）。一些Cas13变体（例如Cas13a和...
IRDs的表观遗传编辑
基于CRISPR的表观遗传编辑是一种不依赖于突变的疗法策略，可以通过基因激活（CRISPRa）或抑制/干扰（CRISPRi）来调节基因表达，而不改变基因组DNA序列（Cheng等人，2013；Qi等人，2013）。它利用与激活剂（如VPR（Chavez等人，2015）、SAM（Konermann等人，2018）或SunTag（Tanenbaum等人，2014）（CRISPRa）（图5A）或抑制域（如KRAB（Gilbert等人，2013））融合的dCas9...
递送限制和编辑器大小
将CRISPR/Cas9高效递送到视网膜细胞仍然是治疗开发中的一个主要挑战。最常用的递送载体AAVs的载货能力有限（约4.7 kb），无法在单个载体中有效包装Cas9编辑器和引导RNA（Mali等人，2013）。这一限制部分通过使用较小的Cas9蛋白（如SaCas9、Cas12i、Cas12f1等）或分裂intein方法得到了缓解（Maeder等人，2019）...
未满足的需求和未来方向
基于CRISPR的基因编辑技术仍在迅速发展，最近的努力集中在扩大可靶向的致病变异范围和提高编辑精确度上。机器学习引导的工程学使得PAM序列的限制得到放宽，扩大了突变的可访问性和特异性（Silverstein等人，2025）。引入双pegRNA策略（包括twinPE和Bi-PE）扩大了有效的编辑窗口，使得更大的基因组区域能够被编辑...
结论
总之，基于CRISPR的技术彻底改变了遗传性视网膜疾病的治疗开发格局，提供了从基因破坏和替换到碱基编辑、引导编辑和RNA编辑等多种工具，每种工具都有潜力针对特定的突变类型和疾病机制。这些方法在多个IRD模型中展示了在恢复基因功能和改善视网膜结构及视觉结果方面的显著临床前成功...
Egle Galdikaite-Braziene：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、监督、研究、概念化。
Raulas Kru?nauskas：撰写——审稿与编辑、研究。
Emiline Henderson：撰写——审稿与编辑、研究。
Kinga M. Bujakowska：撰写——审稿与编辑、资源准备。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了Open AI来提高文章的可读性和语言表达。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。
关于利益冲突的声明
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