《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Modulation of Wnt/β-Catenin Pathway by Aesculus hippocastanum Extract Enhances Temozolomide Sensitivity in Glioblastoma Cells
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本研究发现，从传统草药七叶树种子中提取的七叶树提取物(HCE)能够显著增强胶质母细胞瘤(GB)标准化疗药物替莫唑胺(TMZ)的疗效。通过体外2D及3D肿瘤模型证实，HCE联合TMZ能协同抑制GB细胞的活力、迁移与克隆形成，其机制涉及对Wnt/β-catenin信号通路的抑制、肿瘤干细胞特性(Nestin, β3-tubulin)的下调，以及线粒体损伤和促凋亡通路(Bax, p53)的激活。这为克服GB对TMZ的耐药性提供了一种有前景的天然产物辅助治疗策略。
引言
胶质母细胞瘤(GB)是成人中枢神经系统(CNS)中最常见且最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，被世界卫生组织(WHO)归类为IV级星形细胞瘤。其特点是生长迅速、弥漫性浸润周围脑组织、异质性强且复发倾向明显。尽管神经外科技术、放疗和化疗方案取得了显著进展，但总体治疗效果仍然有限。目前的标准治疗包括最大程度的安全手术切除，随后进行同步放疗和辅助化疗，使用的药物是口服烷化剂替莫唑胺(TMZ)。然而，该方案仅能适度延长生存期，中位总生存期约为14个月，5年生存率为5%。肿瘤复发几乎普遍存在，而复发性GB通常对常规治疗表现出更大的耐药性。成功治疗的主要障碍之一是GB细胞对化疗，特别是对TMZ的内在性和获得性耐药。这种耐药性是多因素的，涉及遗传和表观遗传机制。其中一个关键决定因素是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的表达，这是一种DNA修复酶，可逆转TMZ诱导的细胞毒性损伤。除了MGMT，其他耐药机制还包括具有增强DNA修复能力的胶质瘤干细胞样细胞(GSCs)亚群的存在、药物外排泵(如ABC转运蛋白)的上调、凋亡信号通路的改变、代谢重编程以及促生存通路(如PI3K/Akt、MAPK和Wnt/β-catenin)的适应性激活。特别是，越来越多的证据提出调节Wnt/β-catenin信号通路作为对抗GB化疗耐药的一种有前景的方法。该通路调节关键细胞过程，如增殖、存活、迁移和GSCs的维持，而GSCs对常规疗法具有高度耐药性。Wnt/β-catenin在GB中的异常激活会促进致癌靶标(如Cyclin D1、MYC和Bcl-2)的转录，从而支持肿瘤生长和逃避凋亡。抑制该通路已被证明可以通过增强TMZ诱导的细胞毒性来使胶质瘤细胞对TMZ敏感。因此，靶向Wnt/β-catenin可能提供一种协同机制来增强标准化疗方案的疗效。然而，GB在CNS内的解剖位置带来了独特的治疗挑战，包括许多潜在有效药物穿过血脑屏障(BBB)的渗透有限，这限制了其生物利用度。鉴于这些临床和分子复杂性，人们越来越关注探索能够使GB细胞对TMZ和其他治疗敏感的组合疗法和辅助疗法。这包括研究能够调节GB关键通路的小分子抑制剂、免疫疗法和天然化合物。源自药用植物的天然化合物作为补充治疗剂正获得关注；这些物种通常表现出多靶点活性，并且可以调节参与癌症进展的关键信号级联反应。其中，七叶树提取物(HCE)传统上因其抗炎、抗氧化和血管保护特性而被使用。其主要生物活性成分七叶皂苷(escin)已通过抑制细胞增殖、诱导凋亡和调节炎症通路在几种癌症模型中证明了抗肿瘤作用。本研究的假设是HCE可能调节GB细胞中的Wnt/β-catenin活性，并在此过程中使其对TMZ诱导的细胞毒性敏感。因此，本研究调查了HCE与TMZ联合使用对GB细胞活力、增殖和凋亡的影响，特别关注Wnt/β-catenin通路作为潜在的机制联系。
材料与方法
研究中使用的HCE水溶性提取物由墨西拿大学化学系提供，为干燥粉末形式。HCE提取物的制备、定性和定量分析如前所述。研究中使用的标准化干提取物含有19.55%的七叶皂苷。研究使用了人U87 MG和A172胶质母细胞瘤细胞系。细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM培养基中培养，并置于37°C、含5% CO2的湿润培养箱中。U87和A172细胞用递增浓度的HCE(从62.5–800 μg/mL)和TMZ(100 μM)处理24小时和48小时，单独或联合使用。通过MTT法测量细胞活力。通过伤口愈合实验和集落形成实验评估抗迁移和抗增殖效果。通过蛋白质印迹法分析β-catenin、Wnt-1、Bcl-2、p53和Bax等蛋白的表达。通过ELISA试剂盒测量磷酸化GSK-3β(Ser9)和总GSK-3β的水平。通过免疫荧光(IF)评估巢蛋白(Nestin)和β3-微管蛋白(β3-tubulin)的表达。通过MitoTracker Red染色评估线粒体损伤。通过TUNEL检测评估细胞凋亡。测量了活性氧(ROS)、活性氧调节剂1(ROMO-1)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、3-硝基酪氨酸(3-NT)和亚硝酸盐(NO2-)等氧化和硝化应激标志物的水平。建立了U87细胞的3D球状体模型，并评估了球状体面积的变化。对球状体进行苏木精-伊红(H&E)染色和碘化丙啶(PI)染色以评估形态和细胞死亡。通过免疫荧光和蛋白质印迹分析球状体中p53的表达。数据来自3次独立实验，使用GraphPad Prism 9.5.1软件进行统计分析。
结果
HCE和TMZ联合使用对GB细胞活力的影响
为了评估HCE对GB细胞活力的影响及其增强TMZ敏感性的潜力，用递增浓度的HCE(62.5、125、250、500和800 μg/mL)单独或与TMZ(100 μM)联合处理U87和A172细胞24和48小时。HCE单独使用在较高浓度下在两个时间点均降低了U87和A172细胞的活力，在48小时观察到的细胞毒性效应更明显。TMZ单药治疗也产生了相当大的细胞毒性效应。然而，与HCE联合治疗显著增强了TMZ诱导的细胞毒性，特别是在较高的HCE浓度下。TMZ与250 μg/mL、500 μg/mL和800 μg/mL HCE的组合在48小时显著降低了GB细胞活力，提示协同作用。值得注意的是，TMZ与800 μg/mL HCE的组合诱导了过度的细胞毒性，由于细胞活力可能过差，导致后续的机制分析无法进行。因此，对于所有进一步的实验，我们选择了500 μg/mL的HCE浓度进行联合治疗，因为它在48小时对GB细胞与TMZ提供了强大的细胞毒性协同作用，同时保持了可接受的下游检测细胞活力。
HCE和TMZ联合使用对集落形成和伤口闭合的影响
为了进一步评估HCE和TMZ联合使用的抗增殖和抗迁移效果，我们在U87和A172细胞中进行了伤口愈合和集落形成实验。在伤口愈合实验中，HCE或TMZ单药治疗在48小时部分抑制了伤口闭合，表明与对照组相比细胞迁移减少。然而，联合治疗导致伤口闭合显著受损，表明HCE和TMZ的共同给药显著损害了GB细胞的迁移。同样，在集落形成实验中，与对照组相比，HCE和TMZ单药治疗均导致集落数量减少，表明克隆形成潜力降低。然而，HCE和TMZ联合使用产生了更显著的效果，集落数量明显减少，几乎完全抑制了集落生长。
HCE和TMZ联合使用对Wnt/β-Catenin信号通路的影响
为了研究HCE观察到的化疗增敏作用是否通过调节Wnt/β-catenin信号通路介导，用HCE(500 μg/mL)、TMZ(100 μM)或其组合处理U87细胞48小时。单独使用HCE处理导致β-catenin和Wnt-1表达与对照组相比适度下调，提示抑制作用。单独使用TMZ也显著降低了β-catenin和Wnt-1的表达。然而，联合治疗显著降低了它们的表达，表明有效抑制了β-catenin/Wnt通路的激活。此外，我们通过ELISA试剂盒评估了U87细胞裂解物中磷酸化GSK-3β(Ser9)和总GSK-3β的水平，显示联合疗法与单独的HCE和TMZ治疗相比显著降低了它们的水平。为了进一步探索Wnt/β-catenin通路的调节，我们评估了胶质瘤干细胞样细胞标志物巢蛋白(Nestin)和神经元分化标志物β3-微管蛋白(β3-tubulin)的表达。与对照组相比，单独使用HCE处理显著减少了巢蛋白阳性细胞的数量，但不影响β3-微管蛋白。单独使用TMZ治疗获得了类似但更一致的结果，成功减少了两种标志物的阳性细胞数量。有趣的是，联合治疗导致巢蛋白和β3-微管蛋白更显著地减少。
HCE和TMZ联合使用对线粒体损伤和凋亡通路的影响
考虑到凋亡在GB中的关键作用，我们探索了HCE和TMZ联合治疗是否诱导U87细胞线粒体功能障碍并激活凋亡。MitoTracker Red染色显示，与对照组和HCE组相比，单独使用TMZ处理的U87细胞线粒体形态发生改变，表明早期线粒体应激。这些改变在联合组中明显更为显著。Bax的免疫荧光显示，与每种单独治疗和对照组相比，暴露于联合治疗的U87细胞中阳性细胞数量增加。HCE和TMZ的促凋亡效应通过TUNEL染色进一步证实，该染色显示联合治疗组中TUNEL阳性细胞显著增加，表明凋亡激活增强。与这些观察结果一致，蛋白质印迹分析表明，联合疗法处理的U87细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2下调，证实了先前的结为了使我们的凋亡通路数据更可靠，我们还在A172细胞系中研究了p53和Bax的表达。
HCE和TMZ联合使用对氧化和硝化应激的影响
为了评估HCE和TMZ联合使用的抗氧化效果，在U87细胞中分析了多种氧化应激标志物。单独使用HCE(500 μg/mL)和TMZ(100 μM)处理导致细胞内ROS水平、ROMO-1和MDA与对照组相比适度降低。值得注意的是，HCE和TMZ联合处理导致与每种单独治疗相比，促氧化物质更显著地减少。与此一致，与对照组和单独治疗相比，联合组的GSH水平显著增加，进一步支持了积极的抗氧化效果。此外，我们评估了HCE和TMZ对硝化应激标志物3-NT和NO2-的影响，表明联合治疗与对照组和每种单独治疗相比显著降低了它们的水平。
HCE和TMZ联合使用对U87球状体面积的影响
为了评估HCE和TMZ对3D肿瘤生长的影响，用HCE(500 μg/mL)、TMZ(100 μM)或其组合处理U87球状体4天，并在第1、3和7天测量球状体面积。在第1天和第3天，实验组之间球状体面积没有显著差异。然而，在第7天，与对照组和单药治疗相比，HCE和TMZ联合处理导致球状体面积显著减少。
HCE和TMZ联合使用对3D球状体模型形态改变和细胞死亡的影响
为了进一步研究HCE和TMZ对3D肿瘤结构和细胞活力的影响，我们进行了H&E和PI染色。H&E染色显示，对照组样品中球状体结构保持完整，而单独使用HCE或TMZ治疗则有所不同。然而，联合治疗导致坏死核扩大和尺寸减小。PI染色证实了这些发现，显示对照组和单药治疗组荧光最小，而联合治疗诱导了PI阳性核的显著增加，表明球状体内广泛的膜完整性丧失和晚期细胞死亡。此外，我们通过免疫荧光评估了HCE和TMZ对凋亡标志物p53的影响。与对照组相比，TMZ处理的球状体中p53阳性细胞略有增加，与HCE组相比也是如此；然而，在联合组中检测到p53的显著上调。关于p53的数据也通过蛋白质印迹分析进行了评估，显示联合用药与单独治疗相比增加了p53的表达，但差异不显著。
讨论
GB是成人中最具侵袭性和致死性的原发性脑肿瘤，其特征是高增殖能力、侵袭性和对标准疗法的耐药性。尽管有手术切除后放疗和化疗等可用策略，但预后仍然很差。这凸显了对新治疗方法的迫切需求。最近，越来越多的注意力转向使用天然化合物作为常规化疗的辅助剂，旨在提高疗效并克服耐药性。在此背景下，我们的研究调查了HCE和TMZ对GB细胞的联合效应，使用了单层培养和3D球状体模型以更好地模拟体外肿瘤行为。在U87和A172单层模型中，HCE(500 μg/mL)和TMZ(100 μM)联合治疗导致细胞活力比单独使用任一药物更显著地降低，提示协同细胞毒性效应，尤其是在48小时。此外，HCE和TMZ的组合显著减少了集落形成细胞的数量，并抑制了两种GB细胞系的伤口闭合。GB中经常异常激活多种信号通路，包括Wnt/β-catenin信号通路。该通路在GB的增殖、干细胞性和治疗耐药性调节中已得到充分证实，其抑制可能有助于使肿瘤细胞对TMZ敏感。与此一致，联合治疗导致Wnt/β-catenin信号通路显著下调，U87细胞中β-catenin和Wnt-1蛋白表达降低证明了这一点。考虑到糖原合成酶激酶3β(GSK3β)通过其磷酸化和随后的降解在调节β-catenin稳定性中的关键作用，我们还评估了总GSK3β及其在Ser9位点的磷酸化形式(p-GSK3β)。联合治疗导致p-GSK3β(Ser9)/总GSK3β水平降低，进一步支持了β-catenin信号通路的抑制。已知β-catenin调节参与细胞干细胞性的多个基因的转录，包括癌症中的巢蛋白。干细胞性和分化标志物的表达在GB中显著改变。在U87单层模型中，神经祖细胞的已知标志物巢蛋白在联合治疗后下调，神经元分化和胶质瘤侵袭性标志物β3-微管蛋白也是如此。这些发现表明，除了其细胞毒性效应外，HCE还可能调节Wnt/β-catenin信号通路和GB细胞的分化状态。除了降低细胞活力和干细胞性特征外，HCE和TMZ联合治疗诱导了显著的线粒体损伤，这有助于激活GB细胞的内在凋亡通路。线粒体在调节凋亡中起着核心作用，其功能障碍通常与膜电位丧失、ROS产生增加和促凋亡信号级联的激活有关。我们的数据表明，联合疗法增加了Bax阳性细胞的数量，Bax是Bcl-2家族的关键促凋亡成员。Bax激活和易位至线粒体外膜是通透化和细胞色素c释放的关键步骤，导致细胞死亡。TUNEL检测进一步证实了凋亡的诱导，显示联合治疗组中TUNEL阳性细胞的数量高于每种单独治疗。这些发现得到了U87单层细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调的支持，表明联合疗法有效地将平衡转向促凋亡环境，有利于线粒体功能障碍和程序性细胞死亡。GB细胞已知存在于慢性氧化应激状态，由高代谢活性、快速增殖和功能失调的线粒体驱动。这导致氧化还原稳态改变，其特征是ROS的过量产生和抗氧化能力减弱，共同导致基因组不稳定性、治疗耐药性和肿瘤侵袭性。在我们的研究中，我们观察到HCE和TMZ联合治疗显著改变了GB细胞的氧化还原状态。有趣的是，联合疗法导致ROS产生和ROMO-1水平降低，ROMO-1是一种参与ROS生成的线粒体蛋白，提示氧化还原环境的重新平衡。除了ROS，还通过测量MDA水平评估了氧化损伤的标志脂质过氧化。HCE和TMZ的组合显著降低了MDA含量，表明细胞膜的氧化损伤减少。重要的是，这种氧化应激的减少伴随着GSH水平的显著增加，GSH是细胞内主要的内源性抗氧化剂，表明联合疗法不仅减少了ROS的产生，还加强了抗氧化防御系统，有助于整体氧化还原平衡。此外，我们将研究扩展到硝化应激反应，硝化应激在GB中经常升高并有助于肿瘤进展，表明联合治疗降低了3-NT和亚硝酸盐的水平，这是硝化应激的重要标志物。为了进一步验证HCE和TMZ组合的抗肿瘤疗效，我们采用了3D球状体模型，该模型比传统的2D单层培养更能准确模拟体内肿瘤微环境。我们的结果表明，与对照组和单独治疗相比，HCE和TMZ的组合随时间诱导球状体面积显著减少。这一发现反映了在3D环境中肿瘤样生长的明显抑制，加强了在单层培养中观察到的协同抗增殖效应。同时，联合组中PI阳性细胞显著增加，特别是在球状体核心区域，表明在整个球状体体积内而不仅限于外围有明显的细胞死亡诱导。这表明联合治疗在穿透和杀死3D结构中的细胞方面更有效。有趣的是，分析显示，联合处理的球状体中p53增加，p53是参与DNA损伤反应的关键肿瘤抑制因子。这种对联合治疗的上调反应表明凋亡通路和细胞应激反应的激活增强，进一步支持了HCE和TMZ诱导的促凋亡效应。总之，我们的数据强化了HCE在体外(包括3D GB球状体模型中)发挥可测量的抗肿瘤作用的观点。然而，本研究有几个局限性需要强调，包括缺乏药代动力学数据以及未在原位GB模型中进行抗肿瘤功效评估。未来的体内研究将需要评估生物利用度和生物分布。鉴于七叶皂苷是一种高分子量皂苷，因此不太可能穿过血脑屏障，可能需要额外的递送策略，例如基于纳米颗粒的配方或替代给药途径，以实现有效的CNS靶向。
结论
总之，我们的研究表明，HCE和TMZ的组合在GB细胞中发挥协同抗肿瘤作用，无论是在单层还是3D球状体模型中，都是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路以及下调干细胞性和胶质瘤侵袭性标志物来实现的。这些发现突出了HCE作为GB中TMZ辅助剂的潜力。然而，尽管有这些令人鼓舞的体外观察结果，仍需要额外的验证。在荷瘤小鼠中进行体内研究对于确定药代动力学和治疗活性至关重要，尤其是在原位背景下。同时，使用患者来源的GB细胞对于确认观察到的效应在临床相关细胞系统中得以维持非常重要。这些步骤对于确定本研究中观察到的HCE有前景的生物活性是否可以在体外环境之外得到证实是必要的。
