《The Open Medicinal Chemistry Journal》：Spacer-engineered carboxylated curdlan derivatives for dendritic cell activation and cancer immunotherapy
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癌症免疫治疗需要将抗原高效递送至树突状细胞（DC）胞质并同时促使其成熟，以引发强大细胞免疫。传统疫苗载体常需复合多种组分来实现上述功能，增加了系统复杂性并引发安全性担忧。为解决此问题，研究人员开展了“空间间隔工程化的羧化可德兰衍生物”这一主题的研究，合成了具有不同间隔基结构的羧化可德兰衍生物。研究发现，含有环己基间隔基的Chex-Curd具有强效佐剂活性和pH响应性，能增强抗原通过MHC I类途径的呈递，并在小鼠肿瘤模型中诱导了强大的CD8+T细胞反应，显著抑制了肿瘤生长。该研究为开发集DC激活与胞质抗原递送功能于一体的新一代癌症疫苗平台提供了新策略。
想象一下，我们的免疫系统拥有一支精锐部队——细胞毒性T淋巴细胞（CTL），它们能精准识别并消灭癌细胞。但这支部队的激活，需要一位“教官”将癌细胞的特征（即抗原）准确无误地“呈递”给它们。在人体内，树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）正是这位关键教官。有效的癌症免疫治疗，核心在于将抗原高效地“送入”树突状细胞的胞质溶胶（cytosol），并同时“训练”（即激活）这些教官，从而激发CTL主导的强大细胞免疫。然而，现实是骨感的。传统的疫苗载体为了实现“递送”和“激活”这两个目标，常常需要将具有不同功能的材料（比如作为佐剂的材料和促进递送的材料）组合在一起。这种“多合一”的配方不仅让整个系统变得复杂，增加了不同组分之间功能相互干扰的风险，还需要逐一确保每种材料的安全性，这严重阻碍了其作为疫苗系统的实际应用。因此，社会亟需一种更简单的、能同时集成DC激活和胞质递送功能的抗原载体。
在这个背景下，基于多糖的佐剂因其固有的免疫调节功能、生物相容性和安全性而备受关注。可德兰（curdlan）是一种由细菌产生的线性β-1,3-葡聚糖，它本身就能被DC表面的Dectin-1和Toll样受体（TLR）4等受体识别，从而激活DC。研究团队的前期工作发现，将羧基（-COOH）通过酯键引入到可德兰的羟基上，可以赋予其pH敏感性——在弱酸性的内体环境中，羧基质子化使聚合物变得疏水，从而能促进脂质体与内体膜的融合，实现模型抗原蛋白的胞质递送。同时，多糖衍生物与DC表面受体的相互作用还能增强DC的激活。这为在一个材料中同时实现pH响应性和佐剂活性提供了可能。那么，如何进一步优化这种“二合一”材料的性能呢？研究人员将目光投向了连接羧基和可德兰主链的“间隔基”（spacer）。他们推测，间隔基的结构（特别是其疏水性）可能会强烈影响聚合物的疏水性、羧基的解离常数（pKa），进而调控其在酸性pH下与脂质膜的相互作用，并可能通过增加与受体的亲和力来增强其作为高效佐剂的生物活性。
为了验证这一设想，日本大阪府立大学应用化学系的Shu Xin和Eiji Yuba研究员开展了一项系统研究，成果发表在《The Open Medicinal Chemistry Journal》上。他们合成了一系列具有不同间隔基结构的羧化可德兰衍生物，并深入探究了间隔基结构对其pH敏感性、免疫细胞激活特性以及体内外抗肿瘤免疫疗效的影响。这项研究为设计下一代集成了DC激活与胞质抗原递送功能的癌症疫苗平台提供了重要的理论基础和实验依据。
研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：1）高分子合成与表征：通过酸酐与可德兰的酯化反应，合成了五种羧化可德兰衍生物，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）和静态光散射（SLS）进行了化学结构与分子量表征。2）理化性质分析：通过酸碱滴定测定表观pKa，利用浊度法和荧光染料渗漏实验评估聚合物的pH响应性及其与脂质膜的相互作用。3）体外细胞实验：使用小鼠树突状细胞系DC2.4，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子（TNF-α, IL-12）分泌，通过流式细胞术（FACS）分析细胞表面成熟标志物（CD40, CD80）和抗原呈递（MHC I/OVA肽复合物），并通过共聚焦显微镜观察抗原（FITC标记的卵清蛋白，FITC-OVA）的细胞内分布。4）体内免疫学与治疗评估：使用C57BL/6小鼠模型，通过皮下免疫接种抗原-聚合物偶联物，随后分析脾脏免疫细胞组成、抗原特异性干扰素-γ（IFN-γ）产生，并最终在接种E.G7-OVA肿瘤细胞后评估肿瘤生长抑制效果和生存期。
3.1. 羧化可德兰的合成
研究人员成功合成了五种羧化可德兰衍生物：琥珀酰化可德兰（Suc-Curd）、戊二酰化可德兰（Glu-Curd）、3-甲基戊二酰化可德兰（MGlu-Curd）、3,3-二甲基戊二酰化可德兰（dMGlu-Curd）和2-羧基环己烷-1-羧基化可德兰（Chex-Curd）。1H NMR谱图证实了酯化的成功。通过调整投料比，获得了羧基单元引入率约为30%的衍生物，用于后续性能比较。
3.2. 可德兰衍生物的表征
静态光散射表明，羧化修饰使可德兰的分子量从约700 kDa降至200 kDa左右。刚果红实验显示，羧基的引入破坏了可德兰天然的三螺旋结构。酸碱滴定表明，间隔基疏水性越强，衍生物的表观pKa值越高（Chex-Curd最高，为5.64）。浊度实验发现，疏水性更强的衍生物（如Chex-Curd和dMGlu-Curd）在较高的pH和较低的质子化程度下就会发生聚集。
3.3. 可德兰衍生物与脂质体的pH响应性相互作用
荧光染料渗漏实验显示，只有具有较强疏水间隔基的衍生物（MGlu-Curd、dMGlu-Curd和Chex-Curd）能在弱酸性pH下诱导脂质体膜的不稳定并释放内容物。其中，Chex-Curd在最高的pH（6.78）和最低的质子化程度（0.06）下即可启动释放，表明其间隔基的强疏水性促进了与脂质膜的相互作用。
3.4. 间隔基结构对羧化可德兰佐剂特性的影响
细胞毒性实验显示，除高浓度dMGlu-Curd外，其他衍生物均无显著细胞毒性。ELISA检测发现，所有羧化可德兰均能诱导DC2.4细胞分泌TNF-α和IL-12，表明其具有佐剂活性。其中，Chex-Curd诱导的细胞因子水平最高，远超其他衍生物甚至阳性对照脂多糖（LPS），且即使在低浓度下也能高效诱导IL-12分泌。流式细胞术证实Chex-Curd能上调DC成熟标志物CD40和CD80的表达。受体抑制实验表明，羧化可德兰（尤其是Chex-Curd）诱导的TNF-α产生依赖于TLR1/2和TLR4信号通路，而非Dectin-1。有趣的是，将Chex基团引入无内在佐剂活性的葡聚糖（dextran）上，也能赋予其类似的强佐剂活性，提示增强的疏水性是提升受体亲和力的关键。
3.5. 羧化可德兰对DC抗原摄取和呈递的影响
虽然Chex-Curd略微降低了DC对FITC-OVA的摄取量，但共聚焦显微镜观察发现，它和Suc-Curd都能显著减少细胞内的荧光斑点数量，提示其可能破坏了内体/溶酶体结构，促进了抗原向胞质的泄漏。为了避免Chex-Curd与OVA物理混合时形成大颗粒聚集体，研究人员制备了OVA-聚合物偶联物。流式细胞分析显示，只有Chex-Curd-OVA偶联物能显著增强OVA表位肽通过MHC I类分子的呈递，这证实了Chex-Curd能促进抗原的胞质递送和交叉呈递。
3.6. 羧化可德兰在癌症免疫治疗中的体内性能
小鼠体内实验表明，皮下注射Chex-Curd-OVA偶联物能显著增加脾脏中CD8+效应记忆T细胞的比例，而Suc-Curd-OVA则主要增加CD4+效应记忆T细胞。体外再刺激实验证实，两种偶联物均能诱导OVA特异性的IFN-γ产生。最重要的抗肿瘤实验结果显示，预先免疫Chex-Curd-OVA能完全抑制E.G7-OVA肿瘤在大多数小鼠体内的生长，并显著延长生存期；而Suc-Curd-OVA仅产生轻微抑制效果；单独的OVA则无效。这表明Chex-Curd诱导的、以CD8+T细胞为主导的细胞免疫具有强大的治疗潜力。
结论与讨论
本研究通过“间隔基工程学”策略，成功设计并合成了一系列羧化可德兰衍生物。研究发现，间隔基的疏水性是调控聚合物pH响应性和免疫佐剂活性的关键因素。疏水性更强的间隔基（尤其是环己基）能使聚合物在更低的质子化程度和更高的pH下发生疏水转变，从而更有效地与内体膜相互作用，促进抗原的胞质逃逸。更重要的是，这种疏水性的增强显著提升了聚合物与TLR1/2、TLR4等模式识别受体的相互作用，赋予了其强大的DC激活能力。
其中，明星分子Chex-Curd脱颖而出。它不仅能高效激活DC，促进促炎细胞因子（TNF-α， IL-12）分泌和成熟标志物表达，还能在弱酸性内体环境下破坏膜结构，将偶联的抗原蛋白释放到胞质中，进而通过MHC I类途径高效呈递。这种“激活”与“递送”功能的完美集成，在体内成功诱导了以抗原特异性CD8+T细胞为主导的细胞免疫应答，并在肿瘤模型上取得了卓越的治疗效果。
这项研究的意义重大。它首次系统阐释了通过精细调控多糖佐剂分子中“间隔基”这一微观结构，可以同时优化其“物理特性”（pH响应性）和“生物功能”（佐剂活性），从而将两种必需的疫苗功能整合于单一材料之中。这简化了疫苗载体的设计，降低了多组分系统的复杂性和潜在风险，为开发新一代高效、安全的治疗性癌症疫苗提供了一个极具前景的分子平台。未来的研究可以在此基础上，进一步探索间隔基化学结构的多样性，优化给药方案，并进行更全面的临床前安全性评价，推动该技术向实际应用迈进。
