棕榈酰乙醇酰胺（PEA）调控骨骼肌细胞周期进程并诱导抗炎转录组特征：对肌肉再生与适应性的启示

《Physiological Reports》：Palmitoylethanolamide (PEA) regulates cell cycle progression and promotes an anti-inflammatory transcriptomic signature in C2C12 skeletal muscle cells

（编辑推荐）本研究首次系统揭示棕榈酰乙醇酰胺（PEA）对C2C12骨骼肌细胞的双重作用：一方面，PEA诱导肌母细胞G0/G1期阻滞、减少肌管数量但提升融合指数；另一方面，通过转录组测序（RNA-seq）发现PEA下调核因子κB（NF-κB）靶向细胞因子，上调干扰素相关基因，塑造抗炎/免疫启动特征。研究还发现肌肉细胞可能优先依赖N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（NAAA）代谢PEA。这些发现为PEA在肌肉再生、适应及抗萎缩干预中的应用提供了新见解。

引言

棕榈酰乙醇酰胺（Palmitoylethanolamide, PEA）是一种内源性脂肪酸酰胺，在神经和免疫细胞中以其抗炎、镇痛和神经保护特性而闻名。它通过多种途径发挥作用，包括激活GPR55和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α），以及间接调节TRPV1通道和CB2受体。尽管其在其他组织中的作用已得到描述，但PEA对骨骼肌的直接影响，特别是在肌生成和转录反应方面，仍然很大程度上未知。本研究旨在填补这一空白，探究PEA是否影响骨骼肌肌生成，并描绘分化C2C12肌管对PEA暴露的急性转录组反应。

材料与方法

研究使用了小鼠C2C12成肌细胞系。通过代谢活性（MTT）测定和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）排除实验评估了PEA（1-100 μM）对终末分化肌管的剂量耐受性。基于耐受性结果，选择10 μM PEA进行后续实验。通过免疫荧光染色（使用肌球蛋白重链抗体MF-20和核染料DAPI）分析肌管形态（肌管数量、面积和核融合指数NFI）。使用PI染色和流式细胞术分析肌母细胞的细胞周期分布。为了探究转录反应，将分化的肌管用10 μM PEA或载体对照处理24小时，然后进行RNA提取、文库制备和下一代RNA测序（RNA-seq）。使用DESeq2进行差异表达基因分析，并使用多种生物信息学工具进行功能富集和通路分析。

结果

1. 剂量耐受性

100 μM PEA处理24小时后，肌管的代谢活性和活细胞百分比均显著降低。因此，选择10 μM作为后续实验的最大耐受剂量。

2. 肌管形态

与对照组相比，10 μM PEA处理在整个分化过程中显著减少了肌管数量（90.3 ± 10.6 vs. 112.6 ± 10.1），但显著增加了核融合指数（37.8 ± 5.7% vs. 30.7 ± 3.2%）。肌管面积没有显著变化。这些结果表明PEA促进了肌核的融合。

3. 肌母细胞细胞周期分析

用10 μM PEA处理肌母细胞24小时，导致细胞在G₀/G₁期显著积累（48.2 ± 1.2% vs. 对照42.3 ± 1.9%），同时S期细胞比例显著减少（21.7 ± 1.2% vs. 25.5 ± 1.2%），这与G₁期阻滞一致，表明PEA抑制了细胞增殖。

4. 对PEA的急性转录组反应

RNA-seq分析发现，与对照相比，PEA处理组有1952个基因差异表达（1028个上调，924个下调）。主成分分析显示基因表达谱在条件间存在明显聚类。功能富集分析表明，差异表达基因在“细胞因子-受体相互作用”、“炎症信号传导”等通路上富集。具体而言，PEA下调了核因子κB（NF-κB）靶向的促炎细胞因子基因（如_Il1a, _Il1b, _Il33），同时上调了干扰素相关基因（如_Stat2, _Oas1b）和趋化因子基因（如_Cxcl14, _Ccl5），呈现出一个抗炎/免疫启动的转录特征。值得注意的是，通常被认为是PEA效应主要介导者的_Ppara基因在C2C12肌管中表达水平极低，且不受PEA处理影响。

5. PEA代谢酶的转录反应

两个酶负责将PEA水解为棕榈酸和乙醇胺：N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（_Naaa）和脂肪酸酰胺水解酶（_Faah）。PEA处理后，_Naaa的表达显著上调，而_Faah的表达未改变且本底水平很低。此外，_Naaa的测序读数比_Faah高约20倍，表明在C2C12肌管中，NAAA依赖的PEA代谢可能占主导地位。

讨论

本研究首次全面描述了骨骼肌肌管对PEA的转录组反应。关键发现包括：PEA诱导肌母细胞G₁期阻滞，这与观察到的肌管数量减少一致；同时，它通过增加核融合指数促进了更融合的表型。转录组分析揭示了一个复杂的免疫调节特征，其特征是NF-κB驱动的促炎信号下调，而干扰素相关通路和某些趋化因子上调，这表明PEA的作用是免疫调节而非单纯的免疫抑制。

一个新颖的发现涉及PEA的代谢。与_Faah相比，_Naaa的表达更高且被PEA诱导，表明骨骼肌可能优先通过溶酶体中的NAAA途径代谢PEA，这与其他组织不同。

尽管PPAR-α通常被认为是PEA的关键靶点，但本研究中_Ppara的低表达和不受影响状态表明，PEA在肌肉中的许多效应可能是通过PPAR-α非依赖途径介导的，例如通过GPR55或其他尚未明确的机制。

局限性

研究的一个主要局限是体外使用的PEA浓度（10 μM）远高于人体口服补充剂后观察到的血浆浓度（约0.02 μM）。此外，体外培养的肌管中可能存在未融合的成肌细胞亚群，这可能影响转录组数据的解读。最后，研究基于mRNA水平的变化，未对蛋白表达或信号通路活性进行正交生化验证。

结论

总之，本研究提供了PEA在骨骼肌细胞中作用的分子图谱，表明PEA使骨骼肌倾向于一种增殖较少但融合更多、炎症缓解的表型，并伴随着免疫通路的转录重编程和对NAAA代谢的偏好。这些发现为未来的体内研究奠定了基础，以测试PEA是否有利于肌肉再生、运动适应或抗萎缩干预。所有RNA-seq数据已公开（GEO编号GSE307376），以供进一步研究和验证。