《Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics》：AlphaFold2-Guided Cyclic Peptide Stabilizer Design to Target Protein–Protein Interactions
编辑推荐：
本文综述了一种基于AlphaFold2(AF2)的计算设计新协议，用于开发能同时结合并稳定蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)界面的环肽分子。该研究成功设计了有望作为PPI稳定剂或PROTAC样降解剂的双功能环肽，为调控关键生物过程及开发新型疗法提供了强大的计算工具。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)在细胞信号传导、代谢调控和疾病发生中扮演着核心角色，对其进行调控具有重要治疗潜力。与已被广泛研究的PPI抑制相比，PPI稳定是一个相对未被充分探索的领域。环肽因其较大的相互作用表面积、高特异性、低毒性以及通过环化增强的稳定性和渗透性，成为一类有前景的PPI稳定剂。然而，现有的计算设计方法大多专注于设计仅结合单个靶标蛋白的肽段，而开发能同时优化与两个蛋白质伙伴结合的稳定剂面临挑战。本研究旨在开发一种计算协议，专门设计能够稳定PPI或作为降解剂发挥作用的环肽。
材料与方法
研究者建立了一套计算设计协议，核心是基于改进的AlphaFold2(AF2)方法，利用ColabDesign框架来生成环肽。该方法的关键在于采用了一个特定的损失函数，该函数不仅优化肽段与单个靶蛋白的相互作用，还同时优化肽段与两个蛋白质伙伴的双重结合。设计过程分为两个阶段：第一阶段，AF2预测靶标-肽段复合物结构，并通过梯度反向传播更新序列；第二阶段，进行半贪婪优化，通过随机突变和评估来选择最佳序列。设计的肽段需经过严格的后期过滤，包括排除含非脯氨酸顺式肽键和游离半胱氨酸的肽段，以确保合成的可行性和避免副作用。此外，还使用ProteinMPNN作为独立过滤器，生成并比较替代序列，以评估设计的特异性。最后，通过分子动力学(MD)模拟和MMGBSA（分子力学广义玻恩表面积）方法计算结合自由能，对过滤后的设计进行物理验证。MMGBSA方法还可用于估算三元复合物中协同结合自由能ΔGα，以评估稳定效果。
研究的工作流程示意图如图1所示
结果与讨论
AF2引导的肽段双结合剂设计与基于物理的过滤
该设计协议旨在构建能够以足够亲和力结合目标PPI中两个蛋白质伙伴的环肽。研究者对每个系统进行了40至200次设计运行，获得了大量高置信度(pLDDT≥0.8)的肽段设计，随后通过ProteinMPNN序列过滤和基于最小BSA的亲和力过滤，最终对每个系统筛选出8-21个肽段设计进行MD验证。
蛋白酶抑制剂的环肽设计
作为概念验证，研究者将方法应用于丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶，旨在设计环肽抑制剂，并与已知的天然高亲和力环肽（向日葵肽STFI-1及其衍生物STFI-TCTR）进行比较。设计出的14元环肽在MMGBSA计算的相互作用能方面与已知强结合剂相似，部分设计甚至更优。这些设计的序列和结构与已知抑制剂显示出显著的相似性，特别是在酶的S1口袋活性位点附近。其中一个设计WS14的整体环状主链结构非常接近已知的向日葵环肽。计算得到的胰蛋白酶接触残基对结合的贡献模式在所有顶级设计以及已知结合剂之间也相当相似，表明对于该靶点，只有有限的序列集合能够产生高亲和力结合。
胰蛋白酶-肽段复合物的结构对比如图2所示
应用于已知环肽稳定剂的PPI系统
Meditope是能与某些单克隆抗体Fab片段重链和轻链界面独特口袋特异性结合的小环肽。研究者基于cQFD meditope与西妥昔单抗抗体Fab片段的复合物结构，设计了新的meditope并进行比较。最终MMGBSA评分预测，排名前五的设计与已知meditope的总体相互作用能相似。有趣的是，设计的环肽与Fab轻链和重链的相互作用强度比meditope更为均衡，这归因于同时优化与两个伙伴相互作用的策略。设计的环肽在结合时显示出几个芳香族残基以及Arg和Gly在蛋白质口袋区域的保守布局。计算得到的相互作用贡献模式在设计肽段之间显示出相似性。
Fab片段系统的相互作用分析如图3A-C所示
接下来，研究者将该方法应用于MCL1二聚体。MCL1是一种抗凋亡蛋白，其大环抑制剂可通过诱导蛋白质同源二聚化发挥作用。研究者设计了14元环肽，以优化与两个MCL1蛋白链的双重结合。MMGBSA评估预测，排名靠前的设计肽段与两个MCL1链均有强烈的相互作用，仅略弱于已知的环肽稳定剂。此外，设计肽段与两个MCL1链的相互作用模式相似，与已知结合剂相当，并显示出一定的结构重叠。应用ProteinMPNN也识别出环肽上蛋白质接触位置非常相似的残基，进一步表明该协议在生成一致且特异性的相互作用模式以稳定PPI方面的效率。
MCL1二聚体系统的相互作用分析如图3D-F所示
值得注意的是，PPI稳定剂的稳定效果可能超越简单的加和性结合自由能贡献，其特征是协同自由能ΔGα。计算表明，在此案例中，无论是已知的环肽稳定剂还是设计肽段，均未显示出显著的协同性。这表明三元复合物确实主要是通过环肽稳定剂介导的，而不是直接的PPI界面接触。
诱导蛋白质-蛋白质相互作用——靶向蛋白降解
靶向蛋白降解(TPD)是一种新兴的治疗策略，通过双功能PROTAC分子将靶蛋白与E3连接酶拉近，进而导致靶蛋白降解。然而，该策略受限于能同时结合两个伙伴的合适小分子配体的稀缺性。因此，研究者尝试应用环肽双结合剂设计方法来设计可能具有PROTAC样功能的双功能肽段。
首先，研究者靶向了Cullin2 RING-pVHL E3连接酶与溴结构域蛋白4(BRD4)的复合物。基于pVHL-PROTAC-BRD4(BD2)复合物的实验结构，研究者旨在为该体系设计环肽基降解剂。最终MMGBSA评估预测，PROTAC与pVHL的相互作用比设计肽段更广泛，而设计肽段与BRD4(BD2)的亲和力与PROTAC相似或更高。值得注意的是，计算表明PROTAC和设计肽段在稳定PPI方面具有相似且强烈的协同性。有趣的是，其中一个设计肽段(MP10)在PROTAC含有羟脯氨酸的位置恢复了一个脯氨酸，而实验表明该羟脯氨酸对于结合pVHL很重要。该残基也被ProteinMPNN恢复，整体序列相似性约为80%。
pVHL-BRD4系统的结构及分析如图4A-C所示
其次，研究者靶向了葡萄糖诱导降解蛋白4同源物(GID4)，它是人CTLH E3连接酶复合物的底物受体。与已知PROTAC相比，设计肽段与GID4的相互作用自由能更有利，但与BRD4(BD1)的相互作用普遍较弱。AF2预测的结构和MMGBSA每残基分解显示，肽段与GID4形成了更广泛的接触，而与BRD4(BD1)的相互作用与PROTAC相似。估算的PROTAC复合物的ΔΔGα远不如pVHL–PROTAC–BRD4体系有利，这与实验观察到的低协同性定性一致。相比之下，肽段复合物显示出改善的协同性和相对于PROTAC更稳定的GID4–BRD4(BD1)界面。与第一个PROTAC系统类似，当将ProteinMPNN应用于设计肽段的主链以寻找可能的替代序列时，观察到了大部分残基的恢复。单个残基相互作用能量贡献的分析也表明了相似性，并强调了Ile 1和26、Leu214以及Ile268在与已知PROTAC以及大多数设计环肽介导相互作用中的重要性。
GID4-BRD4系统的结构及分析如图4D-F所示
设计环肽结合剂的氨基酸组成与特异性
对所有案例的分析表明，非极性范德华力和表面积依赖项在所有情况下都对结合做出了最有利的贡献，而极性贡献总体上通常不利，推测是由于极性和带电基团的部分去溶剂化。设计协议虽然使用了蛋白质-蛋白质复合物模板，但允许靶蛋白-蛋白质复合物发生一些结构适应以容纳环肽稳定剂，从而实现诱导契合结合。在所有案例中，都观察到了蛋白质和界面区域的一些结构变化/适应（相对于模板结构变化高达~2.5 ?）。
对于每个案例，通过仅考虑具有高AF2置信度(pLDDT≥0.8)以及与独立ProteinMPNN生成序列具有高序列同一性的设计，确保了设计的合理性。评估整个高置信度设计集合时发现，序列同一性与伪困惑度（衡量ProteinMPNN对设计序列的确定性）强相关。一个高质量、现实的设计应同时表现出低伪困惑度和高序列同一性，这在所有高级别设计中都有体现。这表明ProteinMPNN对设计的独立评估与设计序列一致，同时预测了低伪困惑度（即高特异性）。然而，低困惑度但中低序列同一性的案例可能识别出有进一步优化潜力的候选物，因为它们表明模型自信地提出了可能改进初始设计的替代序列。
比较本研究的AF2设计协议与ProteinMPNN生成的序列，揭示了氨基酸使用以及一致性的不同趋势。AF2方法总体上产生更高频率的Phe、Trp和His，而ProteinMPNN使用更多的Ala、Val、Leu、Glu和Gln。这些趋势在所有靶标中都能观察到，而Pro和Gly的出现频率则高度可变。通过计算所有研究体系中每个残基的标准差，这种变异性变得更加明显。ProteinMPNN对大多数残基表现出较低的标准差，表明与基于AF2的环肽设计相比，它倾向于在各种系统中生成更统一的序列谱。
设计的与ProteinMPNN生成的序列的氨基酸组成差异如图5所示
结论
本研究开发了一种专门靶向蛋白质-蛋白质界面的环肽双结合剂设计协议。它基于ColabDesign框架，利用AF2进行联合结构-序列优化。使用包含环肽结合剂与两个蛋白质伙伴接触的损失函数，可以有效生成特异性结合界面空腔的环肽。结合序列、结构和基于力场的方法进行过滤和评分，确保了设计的结构合理性和高双重结合亲和力。整个蛋白质-蛋白质复合物及结合设计的重建也允许在与设计的稳定剂形成复合物时发生结构适应。
首先，研究者设计了靶向蛋白酶胰蛋白酶以及两个具有已知环肽结合剂和稳定剂的蛋白质-蛋白质复合物的环肽结合剂。在这些案例中，该协议产生了与已知结合剂/稳定剂相比，与靶标或两个蛋白质结合伙伴具有相似甚至更有利的计算相互作用的顶级环肽。设计肽段虽然起始于随机序列，但部分显示出与已知结合剂的序列相似性以及相互作用模式的部分“保守性”。
其次，研究者设计了潜在的环肽基降解剂，预计能诱导E3连接酶与靶蛋白之间形成复合物，从而将其导向泛素-蛋白酶体降解系统。设计肽段显示出量级相似（有时甚至更有利）的计算相互作用自由能，以及与已知PROTAC分子相似/改善的协同性。这些发现突出了设计肽段作为蛋白质降解剂的潜力，鼓励进行实验验证。
总之，本研究为稳定/诱导PPI的环肽设计开发了一种有前景的计算方法。未来，为了进一步改善药理特性，可以纳入非经典氨基酸和共价修饰，这可以通过AF3、Boltz-1,2、Chai-1和RareFold等模型实现。
