《Peptides》：Apelin-36 Attenuates Diabetic Glomerular Endothelial Hyperpermeability via the KLF2/Occludin Pathway
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本研究通过体外细胞实验和db/db小鼠体内实验，揭示了Apelin-36/APJ轴通过调控KLF2/Occludin通路减轻糖尿病肾病患者肾小球内皮功能障碍的作用，为治疗提供了新靶点。
Jinxiao Jiang|刘洋|程宇豪|熊美琴|周晓琴
中国湖北省黄冈市长江大学黄冈中心医院肾脏科，438000
摘要
肾小球内皮细胞（GEC）通透性的增加是糖尿病肾病（DN）的早期诱因。本研究探讨了Apelin-36/APJ轴在糖尿病条件下的保护作用。体外实验中，高葡萄糖（HG）以时间依赖性方式下调了人肾小球内皮细胞（HRGECs）中APJ的表达和Apelin-36的分泌，并诱导了内皮细胞通透性的增加。Apelin-36治疗可剂量依赖性地缓解这种通透性增加，恢复被HG抑制的Occludin和Krüppel样因子2（KLF2）的表达，并激活Apelin/APJ系统。KLF2敲低或药物抑制APJ会消除Apelin-36的保护作用。体内实验中，Apelin-36治疗改善了蛋白尿，恢复了肾小球Occludin的表达，并部分恢复了db/db小鼠中受损的Apelin/APJ轴。这些发现表明，Apelin-36/APJ轴通过KLF2/Occludin途径保护肾小球内皮功能，显示出其作为糖尿病肾损伤治疗靶点的潜力，尤其是在肾小球内皮方面。
引言
糖尿病肾病（DN）是2型糖尿病（T2DM）最常见的微血管并发症，已成为全球慢性肾病（CKD）和终末期肾病（ESRD）的主要原因[1],[2]。随着糖尿病发病率的持续上升，DN的发病率也在逐年增加。统计数据显示，大约30%至40%的糖尿病患者会发展为DN[3]。近年来，这给全球医疗系统带来了巨大负担。DN的病理特征主要表现为肾小球硬化和肾间质纤维化，伴随肾功能逐渐下降[4]。更严重的是，DN的发生和发展进一步增加了T2DM患者发生心血管疾病和死亡的风险，成为影响其长期预后的关键因素[5]。因此，深入研究DN的发病机制并寻找有效的早期干预策略已成为代谢疾病领域亟需关注的问题。
在DN的早期阶段，肾小球滤过屏障的功能障碍被认为是蛋白尿发生的初始事件和核心病理基础[6]。该屏障由高度极化的有孔内皮细胞和足细胞组成，肾小球基底膜位于它们之间。这一屏障的结构完整性对于维持正常的过滤功能至关重要[7]。在这些细胞中，GEC的功能障碍在DN初期起着关键作用。持续的高血糖状态可诱导内皮细胞活化、炎症反应和细胞间连接处的破坏，导致内皮通透性异常升高——即“内皮通透性增加”。这被认为是微量蛋白尿发生的初始机制[6],[8]。因此，保护和恢复肾小球内皮屏障的功能是延缓DN早期进展的重要治疗策略。
紧密连接是维持内皮屏障功能的关键结构元素，其核心蛋白Occludin的表达和定位对于保持内皮通透性至关重要。紧密连接蛋白的损伤或基因改变会导致上皮细胞通透性升高，从而促进物质异常跨细胞转运[9],[10]。研究表明，在DN动物模型和患者肾组织样本中，Occludin的表达显著下调，其在细胞边缘的连续分布被破坏，这与蛋白尿的严重程度密切相关[11]。
Apelin是一种由脂肪组织和肾脏等器官分泌的内源性肽。Apelin前体被切割成几种不同长度的生物活性异构体，根据其氨基酸数量命名[12]。其中，Apelin-36（36个氨基酸的肽）和Apelin-13（13个氨基酸的肽）是研究最广泛的两种形式。通过与相应的G蛋白偶联受体APJ结合，Apelin发挥多种生理作用，包括调节血管张力、抑制炎症反应和提高胰岛素敏感性[13]。研究表明，在高葡萄糖环境中，Apelin-13能够抑制肾小管上皮细胞的表型转化，从而抑制肾小球细胞中上皮-间充质转化（EMT）过程的启动和进展，最终延缓DN的发生和发展[14]。此外，体内研究结果表明，Apelin-13可以降低血糖水平，减轻胰岛素抵抗，并减少尿蛋白含量[15]。
通过调节KLF2的表达，Apelin/APJ系统在维持内皮细胞平衡中起着重要作用[16]。KLF2作为一种对血流和炎症敏感的关键转录因子，是维持内皮稳态的核心调节分子。实验证据表明，它可以增强关键紧密连接蛋白（如Occludin）的表达[17],[18]。因此，我们假设在DN背景下，Apelin-36可能通过激活APJ受体来上调KLF2的表达，从而促进Occludin的转录和合成，增强内皮屏障功能。
本研究旨在通过体外细胞实验和体内动物模型系统验证Apelin-36/APJ系统对DN中肾小球内皮屏障的保护作用。进一步探讨这种作用是否通过KLF2/Occludin途径介导。研究结果有望建立新的理论框架，并确定DN预防和管理的潜在治疗策略。
实验部分
细胞培养、处理和转导
HRGECs来自中国武汉的中国类型细胞保藏中心（CCTCC）。这些细胞在添加了10% FBS（Gibco，美国）和1% ECGS（ScienCell，美国）的内皮细胞培养基（ScienCell，美国）中生长。培养基中的葡萄糖最终浓度为5.5 mM。培养条件为37°C和5%的CO?浓度。为了建立高葡萄糖模型，细胞暴露于含有30 mM葡萄糖的培养基中，时间分别为6小时、12小时、24小时或48小时。
高葡萄糖损伤了HRGECs中的Apelin/APJ系统
我们首先研究了高葡萄糖对内源性Apelin/APJ系统的影响。高葡萄糖处理导致APJ表达随时间下降，在6小时时 mRNA（图1A）和蛋白质水平（图1B）都显著下调，24小时时达到最低点。同时，高葡萄糖还抑制了Apelin的mRNA表达（图1C），并显著减少了Apelin-36向培养基中的分泌（图1D）。这些数据表明
讨论
DN是全球范围内ESRD的主要病因[21]，早期肾小球内皮通透性的增加是其进展的关键因素。通过一系列体外和体内实验，本研究首次全面系统地证明了Apelin-36在维持DN期间肾小球内皮功能中的保护作用。
伦理声明
本研究的伦理监督由湖北省潜江市中心医院的医学伦理委员会负责。
作者贡献声明
刘洋：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、方法学、概念构思。Jinxiao Jiang：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法学、概念构思。熊美琴：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、资源获取、实验研究。程宇豪：撰写 – 初稿撰写、实验研究、数据分析、数据管理。周晓琴：数据可视化、资源获取、实验研究。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢和资助
本研究得到了“湖北省潜江市中心医院”的支持。
