《Peptides》：The Protective Role of Nesfatin-1 Against TNF-α-Induced Ferroptosis in Chondrocytes: Implications for Osteoarthritis Therapy
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Nesfatin-1通过激活Nrf2/HO-1通路抑制TNF-α诱导的软骨细胞ferroptosis，减少MDA和ROS水平，上调GPx4及FTH表达，维持胶原II和聚集蛋白糖的表达，为骨关节炎治疗提供新靶点。
作者：王悦 | 胡凯莉 | 江凤林 | 韩婷 | 廖张迪 | 高子欣 | 严金华
单位：南昌市第一医院风湿免疫科，中国江西省南昌市东湖区永外正街17号，邮编330008
摘要
骨关节炎（OA）的进展在很大程度上是由软骨细胞的铁死亡（ferroptosis）驱动的，这是一种由氧化应激和脂质过氧化引起的铁依赖性细胞死亡。本研究探讨了Nesfatin-1对TNF-α诱导的小鼠原代软骨细胞铁死亡的保护作用及其潜在机制。我们使用TNF-α（10 ng/mL）建立了铁死亡模型，评估了细胞活力、细胞毒性和关键铁死亡标志物。研究发现，内源性NUCB2/nesfatin-1在软骨细胞中表达，并且其表达水平被TNF-α下调。Nesfatin-1处理显著减轻了TNF-α诱导的细胞毒性并提高了细胞活力。它有效抑制了脂质过氧化，表现为丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平的降低，以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的恢复。Nesfatin-1还减少了4-羟基壬烯醛（4-HNE）蛋白加合物的形成，保持了SLC7A11的表达，并恢复了总谷胱甘肽（GSH）的含量。此外，Nesfatin-1通过下调转铁蛋白受体1（TFR1）和上调铁蛋白重链（FTH）来减少细胞内Fe2+的积累。同时，它抑制了铁死亡的关键驱动因子ACSL4并上调了关键的抑制剂GPx4。重要的是，Nesfatin-1还保持了细胞外基质成分（如胶原II和聚集蛋白）的表达，这与铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的作用类似。从机制上看，Nesfatin-1激活了Nrf2/HO-1信号通路，其保护作用可被Nrf2抑制剂ML385所消除。总之，Nesfatin-1通过激活Nrf2/HO-1通路来缓解TNF-α诱导的软骨细胞铁死亡，表明其具有治疗骨关节炎的潜力。
引言
骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是软骨逐渐退化[1]。软骨细胞中的铁死亡已被证实是OA发病的关键病理机制[2],[3]。这种铁依赖性的细胞死亡形式由氧化应激和脂质过氧化驱动，对软骨基质的降解和软骨细胞活力的丧失起着重要作用[4],[5]。促炎细胞因子TNF-α通过促进ROS的产生和激活铁死亡相关信号通路来加剧软骨细胞的铁死亡[6]。这些病理变化包括铁代谢紊乱（对Fenton反应介导的脂质过氧化至关重要）以及脂质代谢酶（ACSL4和GPx4）表达的改变[7]。尽管已有大量研究，但目前针对软骨细胞铁死亡的治疗方法仍然有限，这凸显了迫切需要新的治疗策略来抑制氧化应激和脂质过氧化，以减缓或阻止OA的进展。
Nesfatin-1最初被鉴定为一种下丘脑调节食欲的肽，具有多种生理作用[8]。它在多种组织（包括心脏、肝脏和脂肪组织）中广泛表达，参与代谢、应激反应和炎症的调节[9],[10]。先前的研究表明Nesfatin-1具有抗氧化特性，在多种细胞类型中均发挥保护作用。在应激状态下的肾上皮细胞中，它通过抑制氧化应激、凋亡和纤维化相关信号通路来发挥保护作用[11]。在巨噬细胞中，Nesfatin-1抑制促炎细胞因子的产生并阻断NF-κB的激活，而NF-κB是炎症反应的主要调节因子[12]。Nesfatin-1由核结合蛋白2（NUCB2）转化而来。内源性NUCB2/nesfatin-1已在人类和啮齿动物的关节软骨及软骨细胞中被检测到[13],[14]。尽管尚未明确Nesfatin-1的特异性受体，但功能研究表明其在多种组织中通过G蛋白偶联或受体独立机制发挥作用[15],[16],[17]。然而，其在软骨细胞中的作用，尤其是在OA过程中TNF-α诱导的铁死亡中的作用仍不明确。
转录因子核因子红系相关因子2（Nrf2）在激活后迁移到细胞核，在目标基因的启动子区域与抗氧化反应元件（AREs）结合，包括血红素加氧酶-1（HO-1）[18]。HO-1是血红素代谢的限速酶，可生成胆绿素、一氧化碳和亚铁离子——这些分子具有强大的抗氧化、抗炎和细胞保护作用[19]。Nrf2/HO-1信号通路构成了对抗氧化应激的关键细胞防御系统，使其成为治疗OA的潜在靶点。本研究探讨了Nesfatin-1是否通过Nrf2/HO-1轴保护小鼠原代软骨细胞免受TNF-α诱导的铁死亡。我们的研究证明了Nesfatin-1通过调节Nrf2/HO-1信号通路在OA治疗中的潜力，为临床干预提供了新的候选药物和理论基础。
实验方法
小鼠原代软骨细胞的分离
原代软骨细胞来自4周龄雄性C57BL/6小鼠（北京维塔尔河实验动物技术有限公司，编号021），分离方法遵循南昌市第一医院动物护理和使用委员会的批准方案。将软骨组织切成1 mm3的小块，首先在37°C下用0.25%胰蛋白酶（Gibco）消化30分钟，然后使用0.1%胶原酶II（Worthington）在DMEM（Gibco）中消化4小时。
Nesfatin-1缓解TNF-α诱导的小鼠原代软骨细胞细胞毒性
我们首先检测了小鼠原代软骨细胞中NUCB2/nesfatin-1的基础表达情况。未经处理的软骨细胞中可检测到NUCB2 mRNA（图1A）。TNF-α（10 ng/mL）处理48小时后，NUCB2 mRNA水平显著降低了约45%（图1A）。相应地，成熟的nesfatin-1蛋白也减少了（图1B）。外源性nesfatin-1（50 nM）将细胞内nesfatin-1蛋白水平恢复到接近对照水平（图1B）。这些发现表明Nesfatin-1在软骨细胞中表达。
讨论
本研究证实Nesfatin-1主要通过调节Nrf2/HO-1通路来保护小鼠原代软骨细胞免受TNF-α诱导的铁死亡。这些发现为Nesfatin-1作为OA治疗药物的治疗潜力提供了新的见解。
伦理声明
动物实验方案获得了南昌市第一医院动物护理和使用委员会的批准。
资助声明
本研究得到了南昌市第一医院科研培养计划（NDSFY2024PYA005）的支持。
作者贡献声明
王悦：撰写、审稿与编辑、数据可视化、结果验证、实验设计、方法学研究、数据分析、概念构建。
江凤林：撰写、审稿与编辑、数据可视化、软件应用、实验设计。
胡凯莉：撰写、审稿与编辑、数据可视化、结果验证、资源管理、实验设计、数据整理。
廖张迪：撰写、审稿与编辑、软件应用、数据分析。
韩婷：撰写、审稿与编辑、数据可视化、资源协调。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
