《Plant Science》：Genetic transformation of rice
(Oryza sativa L.) plants with the Hsp101 genomic fragment containing the coding sequence and its natural, heat-inducible promoter produced transgenics with enhanced heat tolerance
Lisha Khungar|Gayatri Tripathi|Mohit Kumar Swarnkar|Tanya Biswas|Kumar Paritosh|Anil Grover
德里大学南校区植物分子生物学系，新德里110021，印度
摘要 植物Hsp101蛋白在热胁迫下会被强烈诱导，并在耐热性的发展中起着关键作用。我们从IR64水稻中通过PCR扩增了包含Hsp101启动子、编码序列以及5’和3’非翻译区的基因片段。然后利用农杆菌介导的转化技术将其导入野生型IR64水稻植株中。转基因幼苗的Hsp101转录本和蛋白水平更高，在各种基础和获得性胁迫条件下其耐热性也优于未转化的野生型植株。与未转化的幼苗相比，转基因幼苗在热胁迫下以及热胁迫恢复期间的不溶性蛋白聚集物水平更低。在热胁迫和非热胁迫条件下，转基因幼苗的电解质泄漏量更低，蛋白质折叠相关基因的表达也更高。转基因植株的小穗结实率受热胁迫的影响较小。我们得出结论，在同源宿主背景下利用同源基因及其调控序列增强Hsp101的表达可以有效提高耐热性，且不会对生长参数产生不利影响。
引言 自1880年以来，地球的平均全球温度上升了0.8°C（
https://www.giss.nasa.gov/research/ ），自20世纪70年代以来，全球表面温度平均每十年升高0.16°C至0.18°C（Ray等人，2019年）。政府间气候变化专门委员会（IPCC）预测，2030年至2052年间全球温度将再上升1.5°C（
https://www.ipcc.ch/sr15/ ）。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，但对热胁迫（HS）非常敏感。水稻的幼苗生长、分蘖数量、分蘖高度、开花时间、受精、小穗结实率、花粉萌发和灌浆过程都容易受到HS的影响（Jagadish，2020年；Jayaraman和Ramachandran，2024年）。在整株植物水平上，HS会影响叶片方向、叶绿素含量、蒸腾速率和气孔开闭等。在细胞水平上，HS主要会破坏蛋白质构象，导致活性蛋白质的丢失（Bita和Gerats，2013年；Mishra和Grover，2016年；Wahid等人，2007年）。蛋白质稳态是热胁迫下细胞存活的关键。伴侣蛋白和泛素化过程有助于维持细胞蛋白质稳态（Fan和Jespersen，2025年；Hong等人，2003年；Lee等人，2005年；Maxwell等人，2021年；McLoughlin等人，2019年；Parsell等人，1994年；Wu等人，2013年）。为了帮助细胞有效应对HS，热休克蛋白（Hsps）的表达会被增强（Grover，2002年；Mukhopadhyay等人，2024年；Kan等人，2023年；Sarkar等人，2014年）。植物细胞中含有五类主要的伴侣蛋白：Hsp20（sHsps）、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp100，以及两类辅助伴侣蛋白：Hsp10和Hsp60（Kumar等人，2024年；Rebeaud等人，2021年；Singh等人，2010年）。在水稻中，Hsps家族包含近250种蛋白质，属于不同的Hsp类（Kumar等人，2023年；Mas-ud等人，2025年）。ClpB/Hsp100蛋白属于细菌AAA+家族，具有两个核苷酸结合结构域，在从细菌到高等植物的进化过程中保持保守（Gallas，2025年；Tripathi和Grover，2025年）。高等植物中有三种ClpB/Hsp100形式：ClpB1位于细胞质中，ClpB3位于叶绿体中，ClpB4位于线粒体中。在水稻基因组中，ClpB1/Hsp101、ClpB3和ClpB4分别由Os05g044340、Os03g31300和Os02g08490基因位点编码（Singh等人，2010年）。Hsp101是一种独特的伴侣蛋白，具有分解不溶性蛋白聚集物的功能，且是严格热诱导的蛋白（Babbar等人，2023年；Lee等人，1994年；Singh等人，2010年；Singla和Grover，1993年）。除了在HS下被强烈诱导外，Hsp101在种子发育过程中持续表达，直到种子成熟后逐渐减少（Singla等人，1998年；Young等人，2001年）。
Hsp101在建立HS响应中的作用已得到广泛研究。Arabidopsis的AtHsp101和玉米的Zmhsp101突变体对HS敏感（Hong和Vierling，2000年；Nieto-Sotelo等人，2002年）。携带Hsp101中新型单核苷酸多态性（SNP）的新四倍体水稻表现出更高的耐热性（Yu等人，2021年）。Indica和Japonica品种的Hsp101在结构上存在差异，并且对热胁迫的响应也不同（Tripathi等人，2025年）。在CaMV35S启动子下表达AtHsp101的转基因Arabidopsis植株表现出更好的耐热性（Queitsch等人，2000年）。在玉米泛素启动子下持续表达AtHsp101的O. sativa ssp. Japonica水稻植株在耐热性方面明显优于未转化的植株（Katiyar-Agarwal等人，2003年）。此外，在Z. mays泛素启动子或CaMV35S启动子下表达全长O. sativa ssp. Japonica Hsp101序列的O. sativa ssp. Japonica水稻植株也产生了具有更高耐热性的转基因后代（Fang等人，2025年）。过表达CaMV35S启动子驱动的OsHsp101的烟草植株在热胁迫后会长出新叶，而未转化的植株则会死亡（Chang等人，2007年）。使用来自辛诺匹林和甘露糖合成酶基因的元件组成的合成启动子在棉花和烟草中过表达了AtHsp101（Burke和Chen，2015年）。在该研究中，转基因植株的生殖组织（如花粉和种子）比未转化植株具有更高的耐热性。值得注意的是，同时产生了内源Hsp101基因共抑制的株系（Babbar等人，2023年；Burke和Chen，2015年；Queitsch等人，2000年）。然而，使用胁迫诱导型启动子驱动抗性基因来产生转基因植株比使用 constitutive 启动子更为合适（Babbar等人，2023年；Kasuga等人，1999年；Katiyar-Agarwal等人，1999年）。后者还能减少产生内源基因和转基因基因共抑制的株系的频率。使用雌二醇调控的启动子在酵母中表达ScHsp104（酵母Hsp104）可以在没有预处理的情况下提高ScHsp104的表达和耐热性（Lindquist和Kim，1996年）。在热胁迫后，使用其天然启动子表达AtHsp101有效恢复了hot1-3突变体的下胚轴伸长缺陷并恢复了耐热性（McLoughlin等人，2019年）。在最近的一项研究中，通过使用constitutive CaMV35S启动子和天然热诱导型AtHsp101启动子产生了过表达AtHsp101和OsHsp101的转基因Arabidopsis株系（Babbar等人，2023年）。使用天然热诱导型AtHsp101启动子驱动的转基因Arabidopsis株系表现出比使用CaMV35S启动子产生的株系更高的耐热性。此外，当使用天然热诱导型启动子时，共抑制株系的产生也得到了显著减少。
参与OsHsp101表达的遗传元件已经得到了很好的研究（Mishra等人，2016年；Singh等人，2012年；Singh等人，2021年）。用OsHsp101启动子驱动的OsWRKY11转化的水稻株系表现出更强的耐热性和耐旱性（Wu等人，2009年）。OsHsp101 mRNA的5’ UTR区域增强了其翻译效率（Mishra和Grover，2016年）。在本研究中，我们开发了含有OsHsp101基因组序列的转基因IR64 indica水稻植株，包括其自身的天然热诱导型启动子以及包含外显子、内含子、5’和3’UTR区域的基因组区域。我们观察到，与未转化的野生型（WT）植株相比，转基因株系表现出更强的基础和获得性耐热性。
部分内容摘录 构建设计和组织培养 本研究使用了一段长度为4775bp的Hsp101（Os05g44340）基因片段，该片段包含IR64（indica品种）基因上游1319 bp的ATG区域、3106 bp的编码序列和350 bp的3’UTR区域（补充图S1）。该片段以基因组DNA为模板通过PCR扩增，并克隆到pCAMBIA1301载体中（补充图S2）。Hsp101::pCAM1301构建体被引入Agrobacterium tumefacien EHA105菌株中，然后将转化后的细菌进行共培养
过表达Hsp101的转基因水稻株系的生成 将5天大的WT幼苗暴露在42°C和2小时的热胁迫下，q-PCR分析显示ClpB1/Hsp101、ClpB3和ClpB4的转录本分别增加了约712倍、16倍和6倍（补充图S5）。其中ClpB1/Hsp101的转录本增幅最大。在RNA-seq数据集中也观察到了类似的转录本表达趋势（稍后讨论）。接下来，我们扩增了包含IR64中ClpB1/Hsp101的Os05g44340基因片段，并验证了Hsp101序列
讨论 使用带有天然热诱导型Hsp101启动子的AtHsp101基因片段产生的转基因Arabidopsis株系表明，使用热诱导型Hsp101启动子比使用constitutive CaMV35S启动子更能产生具有更高耐热性的转基因株系（Babbar等人，2023年）。水稻是全球重要的粮食作物，热胁迫会降低水稻植株在幼苗期和生殖期的生长和产量
未引用的参考文献 （戈达德空间研究所，2023年；政府间气候变化专门委员会，2023年；Surekha Katiyar-Agarwal和Grover，1999年；Yoshida，1981年）
CRediT作者贡献声明 Anil Grover： 写作——审稿与编辑、监督、方法学、数据分析、概念化。Lisha Khungar： 写作——初稿撰写、方法学、数据分析、概念化。Gayatri Tripathi： 写作——审稿与编辑、方法学、数据分析。Mohit Kumar Swarnkar： 方法学、数据分析。Tanya Biswas： 方法学、数据分析。Kumar Paritosh： 软件应用、方法学、数据分析。致谢 LK感谢印度科学和工业研究委员会（CSIR）的资助；GT感谢印度政府（GOI）的生物技术部（DBT）的奖学金。TB感谢CSIR-IHBT主任对RNA-seq工作的支持。AG感谢印度政府（GOI）的J.C. Bose奖学金、SERB、DBT以及INSA提供的植物胁迫与发育生物学研究职位。
