线粒体转移通过恢复呼吸作用支持新生嘧啶合成并驱动肿瘤进展

《Cancer Research》：Mitochondrial Transfer Rescues Respiration to Support De Novo Pyrimidine Biosynthesis and Tumor Progression Open Access

本研究表明，线粒体DNA缺陷的癌细胞可通过水平线粒体转移获取完整线粒体以恢复呼吸功能，这对维持线粒体内膜酶——二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）的活性至关重要，从而保证新生嘧啶合成。该过程是肿瘤生长的先决条件。通过阻断DHODH或线粒体呼吸链复合物III/IV，可抑制肿瘤生长。研究揭示了肿瘤微环境中线粒体作为关键代谢“捐赠品”的新机制，为靶向嘧啶合成与线粒体转移的抗癌治疗提供了理论基础。

　　

引言：线粒体功能受损的癌症细胞的生存策略

癌症是导致过早死亡的第二大常见原因，其发病率仍在上升，部分原因在于癌细胞具有高度的代谢可塑性、存在癌症干细胞以及水平线粒体转移（HMT）等现象。HMT是一种涉及“供体”和“受体”细胞的细胞间线粒体介导的通信过程，可通过隧道纳米管、细胞外囊泡和间隙连接等多种机制实现。线粒体DNA（mtDNA）缺陷的癌细胞可以从基质细胞（如间充质干细胞）中通过HMT获取线粒体，以恢复呼吸功能。然而，细胞生长所需的ATP主要通过糖酵解产生，这表明呼吸功能的恢复可能并非为了能量供应。研究发现，线粒体呼吸对位于线粒体内膜的二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）的活性至关重要，该酶催化新生嘧啶合成的第四步。因此，本研究的核心问题是探讨新生嘧啶合成在缺乏mtDNA的癌细胞（ρ⁰细胞）驱动肿瘤生长中的作用。

DHODH依赖性呼吸延迟了ρ⁰AOX细胞获取mtDNA

研究人员主要使用小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞及其mtDNA缺陷（ρ⁰）和转染了替代氧化酶（AOX，一种可替代呼吸链复合物III和IV功能的酶）的ρ⁰细胞进行研究。将4T1 ρ⁰细胞及其AOX转染对应物移植到小鼠体内后评估肿瘤组织中mtDNA水平。结果显示，ρ⁰细胞在移植后第5天即可检测到相当数量的mtDNA，并在第20天恢复到亲本细胞水平；而ρ⁰AOX细胞直到移植后第20天才显示出可辨别的mtDNA水平，表明获取过程延迟了两周。mtDNA多态性分析证实，ρ⁰D15和ρ⁰AOX D25细胞中存在来自宿主来源的同质多态性。Western印迹和DNA水平检测显示，在ρ⁰AOX D25细胞中AOX蛋白和基因均无法检测到，这表明当ρ⁰AOX细胞获得mtDNA并恢复常规呼吸后，就不再需要AOX，从而“丢弃”了这一外源基因。

转录组分析进一步支持了mtDNA获取的影响。在ρ⁰、ρ⁰D3和ρ⁰D5细胞中，尽管D5细胞已存在mtDNA，但未检测到mtDNA编码基因的转录本表达；同样，ρ⁰AOX和ρ⁰AOX D15细胞中也无表达，而ρ⁰AOX D20细胞则显示出相当水平的mtDNA编码基因转录本。所有亚系均检测到核编码的呼吸复合物亚基转录本。

研究人员分析了各亚系的常规呼吸和DHODH依赖性呼吸。ρ⁰和ρ⁰D3细胞无常规呼吸，但在ρ⁰D5和ρ⁰D15细胞中部分或大部分恢复；ρ⁰AOX细胞直到第20天才观察到轻微恢复，随后在ρ⁰AOX D25细胞中出现更高的常规呼吸。与常规呼吸恢复模式不同，来源于ρ⁰AOX肿瘤的所有亚系均显示出DHODH依赖性呼吸，表明AOX的存在使细胞能够在不获取mtDNA的情况下维持DHODH功能。DHODH酶活性测定结果显示其变化不大，但ρ⁰和ρ⁰AOX细胞的NAD⁺/NADH比率均下降，表明缺乏常规呼吸。ATP生成分析显示，在亲本细胞及ρ⁰D5和ρ⁰D15细胞中，氧化磷酸化和糖酵解产生的ATP比例约为1:1，而在ρ⁰、ρ⁰D3和ρ⁰AOX细胞中则偏向糖酵解。天然蓝胶电泳结果显示，ρ⁰、ρ⁰D3、ρ⁰AOX和ρ⁰AOX D15细胞中呼吸链复合物和超复合物未组装，这与它们常规呼吸微弱或缺失一致；而ρ⁰D5、ρ⁰D15以及ρ⁰AOX D20和D25细胞中则观察到复合物组装。

最后，肿瘤生长实验表明，ρ⁰细胞形成肿瘤延迟约21天，而ρ⁰AOX细胞仅比亲本细胞延迟约4天。这些结果清楚地表明，缺乏mtDNA及DHODH依赖性呼吸的癌细胞需要通过HMT获取线粒体以恢复DHODH依赖性呼吸，这对于新生嘧啶合成和肿瘤细胞增殖是必需的。相反，表达AOX蛋白的ρ⁰细胞能够维持DHODH依赖性呼吸，从而支持嘧啶合成和增殖，因此移植后并不像其ρ⁰对应物那样迫切需要从基质中获取线粒体。

DHODH的缺失抑制有效的肿瘤生长

研究人员进一步在多种人类癌细胞系（结直肠癌HCT116、三阴性乳腺癌MDA-MB-231、胰腺癌PaTu 8902）中验证DHODH对肿瘤生长的必要性。通过CRISPR-Cpf1/Cas12系统敲除DHODH基因（DHODH^KO）。结果显示，DHODH^KO细胞丧失了DHODH依赖性呼吸，但对常规呼吸无显著影响。DHODH^KO细胞仅在培养基中存在尿苷时才能以与亲本细胞相似的速度增殖，这表明嘧啶补救合成途径支持其生长。将亲本细胞及其DHODH^KO对应物移植到免疫缺陷的NSG小鼠体内后，监测肿瘤生长动力学。结果显示，具有功能性DHODH依赖性呼吸的亲本细胞早期快速形成肿瘤；而DHODH^KO细胞要么完全不形成肿瘤（如MDA-MB-231），要么肿瘤出现较晚且生长极其缓慢（如HCT116和PaTu 8902）。这些数据证实，DHODH是肿瘤有效生长所必需的，其缺失会严重阻碍或完全阻断肿瘤的早期进展，而DHODH^KO细胞中维持的常规呼吸不足以驱动早期肿瘤生长。

mtDNA缺陷导致早期招募促肿瘤免疫细胞

水平线粒体转移（此处以mtDNA获取为代表）是恢复呼吸功能以通过DHODH驱动新生嘧啶合成所必需的。缺乏线粒体基因组的癌细胞需要从基质中招募潜在的供体细胞。为了研究基质组成，研究人员使用了能在免疫活性动物中形成同基因肿瘤的小鼠乳腺癌细胞（4T1、4T1 ρ⁰和4T1 DHODH^KO）。他们探究了与具有功能性新生嘧啶合成的4T1细胞相比，需要HMT获取mtDNA的4T1 ρ⁰细胞在早期肿瘤基质建立和细胞组成上是否存在差异，以及具有嘧啶合成功能障碍的4T1 DHODH^KO模型是否具有相同效应。

将4T1、4T1 ρ⁰和4T1 DHODH^KO细胞移植到Balb/c小鼠体内，并在第3、5、15天评估每种细胞系肿瘤基质的细胞组成，对4T1 ρ⁰细胞还评估了第40天的情况。在肿瘤进展早期（第3天和第5天），移植的ρ⁰和4T1 DHODH^KO细胞中观察到免疫细胞浸润存在显著差异，包括巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。与亲本细胞相比，ρ⁰细胞和4T1 DHODH^KO细胞的基质中，促肿瘤的M2巨噬细胞浸润比例在第3天更高，而M1巨噬细胞则相反。随着时间推移，这三种模型中促肿瘤免疫细胞的浸润模式发生变化。到第15天，亲本肿瘤中M2巨噬细胞和中性粒细胞的浸润增加，表明此时亲本肿瘤可能需要更具保护性的环境；而嗜酸性粒细胞在ρ⁰细胞基质中的比例仍显著高于亲本细胞，这可能是因为嗜酸性粒细胞通过产生生长因子或激活血管生成等方式调节微环境，其促肿瘤作用持续时间更长。此外，还检测了单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的浸润，观察到在ρ⁰细胞移植后，肿瘤微环境中中性粒细胞与T细胞（CD4⁺和CD8⁺）呈负相关，但与调节性T细胞无关。这些发现表明，嘧啶合成失活的细胞将中性粒细胞吸引至肿瘤微环境，从而抑制抗肿瘤CD8⁺和CD4⁺T细胞的效应，促进促肿瘤环境。

对移植后第3、5、15天从ρ⁰细胞形成的肿瘤中分离的细胞进行趋化因子和细胞迁移调节基因表达的评估。有趣的是，虽然亲本细胞中这些基因表达水平较低，但在ρ⁰细胞以及ρ⁰D3和ρ⁰D5细胞中表达较高，而在已经通过从基质获取mtDNA显示出呼吸增强的ρ⁰D15细胞中表达水平较低。这表明缺乏呼吸的癌细胞在移植后早期具有吸引免疫系统细胞的倾向，可能是为了在HMT发生之前建立一个允许肿瘤进展的促肿瘤环境。

此外，在第3天，注射ρ⁰细胞的小鼠血清中检测到显著更高水平的ICAM-1，而注射ρ⁰或DHODH^KO细胞的小鼠血清中M-CSF显著增加。M-CSF作为巨噬细胞的趋化因子将其吸引至肿瘤微环境，并且M-CSF受体也调节巨噬细胞向促肿瘤的M2表型分化。当ICAM-1被抑制时，中性粒细胞无法穿透内皮屏障，从而损害其进入肿瘤。可溶性ICAM-1在巨噬细胞向胶质母细胞瘤的募集过程中也发挥作用。

间充质基质细胞（MSC）在移植ρ⁰细胞后早期被招募

由于间充质基质细胞是最有潜力的线粒体供体候选者，研究人员通过流式细胞术评估了它们在ρ⁰细胞肿瘤微环境中第3、5、15和40天的存在情况。MSC被鉴定为Sca1和CD90双阳性的非免疫细胞（CD45^-）。结果显示，在肿瘤进展早期（第3、5、15天），来源于ρ⁰细胞的肿瘤中，MSC占CD45^-细胞的比例增加，但在ρ⁰D40细胞中水平较低。相反，来源于亲本细胞的肿瘤基质中MSC水平持续较低。这一模式通过使用抗Sca1和CD90抗体对肿瘤切片进行共聚焦显微镜观察得到证实，白色（红色和绿色荧光叠加）表示双阳性细胞。这些结果表明，与亲本对应物相比，ρ⁰细胞在移植后早期以更高水平招募MSC，这与这些细胞作为早期线粒体供体的角色一致。

为了进一步研究MSC作为ρ⁰细胞线粒体供体的作用，研究人员使用了基于线粒体标记有远红色荧光蛋白mKate2的mito::mKate2小鼠来源的MSC与表达胞质GFP的4T1 ρ⁰细胞混合皮下移植的体内共培养系统。在第3、5、15天切下来源于ρ⁰和亲本细胞的肿瘤，将肿瘤组织置于培养皿中。然后检查从肿瘤中生长出来的GFP阳性癌细胞是否存在红色线粒体。结果显示，来源于ρ⁰细胞的肿瘤组织生长的乳腺癌细胞中存在大量红色荧光线粒体。相反，在亲本4T1胞质GFP细胞与mito::mKate2 MSC的共培养中未观察到转移。

由于MSCs被认为通过含有微管蛋白纤维（作为线粒体通道）的隧道纳米管（TNT）将线粒体转移至ρ⁰细胞，研究人员评估了涉及微管聚合/解聚正调控、有丝分裂细胞周期G₁-S期转换负调控以及细胞生长正调控的基因mRNA表达。结果显示，与亲本细胞相比，ρ⁰细胞在无尿苷培养72小时后，这些基因的转录本水平更高。值得注意的是，参与细胞周期负调控的基因在ρ⁰细胞中表达增加，这与DHODH缺失导致细胞周期S期停滞的报道一致。

最后，研究人员评估了移植后肿瘤组织中的癌细胞数量。在移植后第3天和第5天，ρ⁰细胞肿瘤中癌细胞数量较少，而在第15天和第40天，当ρ⁰细胞通过HMT获取mtDNA并恢复呼吸后，癌细胞数量与亲本细胞相似。同时，肿瘤体积测量显示，在第15天之前，ρ⁰细胞来源的肿瘤体积小于亲本细胞来源的肿瘤，之后则变得相似。

综上所述，缺乏功能性线粒体呼吸的癌细胞能够迅速招募巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和MSC等促肿瘤/稳定细胞，以建立支持性微环境，促进其生存，并通过HMT获取功能性线粒体，从而恢复DHODH依赖性呼吸和新生嘧啶合成，最终驱动肿瘤进展。这些发现揭示了癌细胞在代谢压力下重塑微环境以获取关键代谢资源的新机制，并强调了靶向DHODH和线粒体转移作为潜在抗癌策略的重要性。