《Tissue and Cell》：Oxygen-Dependent Regulation of ADAMTS1 by VEGFA Defines a Novel VEGFA–HIF–ADAMTS1 Axis in Hepatocellular Cells
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本研究探讨VEGFA在缺氧条件下对ADAMTS1基因表达及相关信号通路的影响，发现VEGFA通过MAPK和PI3K/AKT通路调控ADAMTS1表达，形成氧敏感正反馈环路，促进血管生成，并得到生物信息学数据支持。
Feray K??KAR|Esra TOKAY|Nelin HACIO?LU|Kubilay GüNERHAN|Yasemin KALFA|Feyza Nur SAV|Merve KARAMAN|Meltem BALABAN|Kübra Zehra KALAY
巴勒克埃西尔大学，科学与文学学院，分子生物学与遗传学系，土耳其巴勒克埃西尔
摘要
ADAMTS1是一种与基质相关的蛋白酶，参与血管生成和肿瘤微环境的重塑，其在缺氧条件下的调控机制尚未完全阐明。血管内皮生长因子A（VEGFA）是血管生成和缺氧信号传导的关键调节因子之一。本研究旨在探讨VEGFA在常氧和缺氧条件下对ADAMTS1基因表达、启动子活性及相关信号通路的影响。结果表明，VEGFA以时间和氧浓度依赖的方式调节ADAMTS1的表达。在缺氧条件下，ADAMTS1的mRNA和蛋白质水平呈双相增长，其反应强度和持久性均高于常氧条件。启动子分析显示，在常氧条件下，VEGFA抑制了长链（P1）和短链（P7）启动子区域的转录活性；而在缺氧条件下，VEGFA降低了P1区域的转录活性，却激活了P7区域的转录。MEK/ERK抑制剂PD98059部分逆转了这一效应，证实了该通路在VEGFA转录调控中的作用。染色质免疫沉淀-定量PCR（Chromatin immunoprecipitation–qPCR）进一步证明，在缺氧条件下，ELK1、c-JUN和ATF-1被招募到多个ADAMTS1启动子区域，其中ATF-1的募集显著增加。此外，研究发现VEGFA通过增加自身表达和稳定HIF-1α，形成了一个对氧敏感的正反馈循环，从而增强ADAMTS1的诱导。GEO和TCGA-LIHC数据集的整合生物信息学分析支持了这些实验结果，揭示了缺氧条件下VEGFA的上调、缺氧评分与VEGFA/HIF1α表达之间的正相关关系，以及ADAMTS1表达、缺氧信号传导和血管生成相关基因网络之间的关联性。这些结果表明ADAMTS1是一个受缺氧调控的基因，其表达通过VEGFA驱动的MAPK和PI3K/AKT信号通路的交汇在转录水平上得到调节，为理解癌症中的缺氧相关细胞外基质重塑提供了机制性见解。
引言
血管生成是从现有血管系统中形成新血管的严格控制的生理过程，对胚胎发育、组织修复和伤口愈合至关重要。然而，在病理条件下，血管生成会促进疾病进展，包括胶原组织疾病、视网膜病变、银屑病，尤其是肿瘤生长和转移。恶性肿瘤在达到约1立方厘米的体积之前，依赖血管生成来维持进一步的增殖和存活（Lugano等人，2020年）。超过这一临界阈值后，新生血管为肿瘤提供氧气和营养，使其能够快速扩张并侵入周围组织。在调控这一过程的众多信号分子中，血管内皮生长因子A（VEGFA）是主要的驱动因素。Senger等人（1983年）最初将VEGFA鉴定为一种增强微血管通透性的因子（VPF）。目前，VEGFA基因家族已有七个成员被鉴定（Byrne等人，2005年）。在多种恶性肿瘤中观察到VEGFA水平升高，包括结肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、直肠癌、肺癌、肝癌、胆囊癌、卵巢癌和子宫癌，以及血管肉瘤和颅内肿瘤（Brogowska等人，2023年）。VEGFA由多种细胞类型分泌，如平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞，其生物学效应主要通过位于内皮细胞上的两种酪氨酸激酶受体VEGFAR1和VEGFAR2介导；而VEGFAR3则主要存在于淋巴内皮细胞中（Ferrara，2001年；Veikkola等人，2000年）。VEGFA基因的可变剪接产生了多种异构体，这些异构体调节毛细血管形态发生和血管生成（Fontanini等人，1997年；Srivastava等人，1988年）。VEGFA165是肿瘤新生血管形成的最特异性介质之一。VEGFA异构体的扩散能力取决于C端区域的肝素结合结构；缺乏这一结构的异构体（如VEGFA121）在细胞外基质中的扩散速度更快（Vempati等人，2014年）。配体结合后，VEGFAR蛋白二聚化并自磷酸化，激活下游分子如PLC-γ、Src、PI3K和PKC。这些信号通过Raf–MEK–ERK和PI3K–Akt通路促进内皮细胞的增殖、存活和迁移（Hu等人，2021年）。
在这个复杂的信号传导和细胞外调节网络中，金属蛋白酶在组织重塑和细胞-基质相互作用中起着关键作用。ADAM（一种解整合素和金属蛋白酶）家族包含依赖锌的酶，这些酶锚定在细胞膜上，并具有解整合素和金属蛋白酶结构域（Porter等人，2005年；Théret、Bouezzedine等人，2021年）。1996年，Kuno等人发现了一类新的分泌蛋白，它们在结构上与ADAMs相关，但含有血小板反应蛋白I型（TSP1） motif，将其命名为ADAMTS（具有血小板反应蛋白基序的解整合素和金属蛋白酶）（Kuno等人，1997年）。与膜结合的ADAMs不同，ADAMTS蛋白被分泌到细胞外基质中，并结合了额外的TSP重复序列，赋予其独特的调控特性。第一个被鉴定出的成员ADAMTS1是从筛选在结肠癌细胞中表达的基因中发现的，这种基因可诱导小鼠消瘦（Kuno等人，1997年）。后续研究表明，表观遗传机制在其转录调控中起关键作用。具体而言，启动子过度甲基化会降低ADAMTS1的转录活性，表明其表达受到DNA甲基化的抑制（Ahlquist等人，2008年）。同时，Chou和Chen（2008年）发现组蛋白去乙酰化抑制剂trichostatin A（TSA）处理可破坏SP1和HDAC6与ADAMTS1启动子的结合，从而减轻其转录抑制（Chou & Chen，2008年）。这些发现强调了ADAMTS1表达受染色质重塑和组蛋白修饰动态的调控。除了表观遗传调控外，ADAMTS1的转录还受到缺氧应激的影响。Hatipo?lu等人（2009年）报告称，暴露于缺氧的内皮细胞中ADAMTS1的mRNA和蛋白质水平显著升高，这一过程由HIF-1α与其启动子区域的结合介导（Hatipoglu等人，2009年）。这一观察结果将ADAMTS1定位为一个对氧敏感的基因，其与肿瘤微环境密切相关（Turkoglu & Kockar，2016年）。实际上，定义为氧浓度低于2%的缺氧状态是肿瘤微环境（TME）的特征（Altunta?等人，2023a）。快速的、不受控制的肿瘤增殖会破坏氧气供应，尤其是在肝细胞癌等实体瘤中，导致不良临床后果。缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α调控广泛的适应性反应，包括代谢重编程、血管生成、上皮-间充质转化（EMT）和治疗抵抗（Bakleh & Al Haj Zen，2025年）。
鉴于这些发现，ADAMTS1作为潜在的肿瘤血管生成抑制剂受到了广泛关注。肿瘤侵袭和转移依赖于细胞外基质的降解，其中金属蛋白酶（如ADAMTS酶）是关键介质。在肝细胞癌、胰腺癌和胃肠道肿瘤中观察到ADAMTS1表达降低，而在结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌中，其启动子过度甲基化与ADAMTS1的沉默相关（Gustavsson等人，2008年；Rocks等人，2008年）。总体而言，这些研究表明ADAMTS1作为血管生成的负调控因子。机制研究进一步表明，ADAMTS1直接与促血管生成因子相互作用。Vazquez等人（1999年）证明ADAMTS1通过其两个C端TSP重复序列与VEGFA165结合，从而抑制VEGFA和FGF2介导的血管生成（Luque等人，2003a；Vázquez等人，1999年）。同样，Tang（2001年）发现ADAMTS-8的第一个TSP重复序列中存在一个特定的GWQRRL/TVECRD motif，该motif介导VEGFA的结合（Tang，2001年）。这些结构和功能关系表明ADAMTS1作为一种细胞外调节因子，可以平衡VEGFA驱动的血管生成过程，维持血管生成网络的平衡。
综合来看，越来越多的证据表明缺氧和VEGFA信号传导是肿瘤相关血管生成反应中ADAMTS1转录和功能的关键调节因子。因此，本研究旨在阐明常氧和缺氧条件下VEGFA和ADAMTS1之间的调控相互作用。以人Hep3B肝癌细胞为主要模型，并加入Saos-2骨肉瘤细胞以评估组织特异性反应，系统研究了VEGFA刺激对ADAMTS1在mRNA、蛋白质和启动子水平上的影响。在初步评估VEGFA诱导的细胞毒性和增殖反应后，进行了时间和剂量依赖性分析，以确定ADAMTS1的动态调控机制。为了阐明涉及的细胞内信号通路，进行了针对MAPK和PI3K/AKT通路的抑制研究，并通过磷酸化特异性免疫印迹独立验证了抑制剂的效力。使用长链和短链ADAMTS1调控片段进行了启动子报告基因检测，以表征常氧和缺氧条件下ADAMTS1的转录反应，并通过染色质免疫沉淀-定量PCR分析评估ELK1、c-JUN和ATF-1在ADAMTS1启动子区域的氧依赖性招募。此外，通过检查VEGFA对VEGFA本身和HIF-1α在转录和蛋白质水平上的调控作用，探讨了潜在的反馈机制。最后，通过对GEO和TCGA-LIHC数据集进行整合计算机模拟分析，将实验结果置于临床相关的缺氧肿瘤环境中进行解读。这种多层次的方法旨在提供VEGFA–HIF–ADAMTS1轴在肿瘤血管生成和微环境重塑中的机制性见解。
部分内容
计算机模拟分析
从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（#GSE271612）和TCGA-LIHC转录组数据中检索了在常氧和缺氧条件下培养的Hep3B肝癌细胞的公开可用基因表达数据。原始计数数据使用DESeq2包进行标准化，差异表达基因（DEGs）的筛选标准为调整后的p值 <0.05且|log?FC| > 1。使用clusterProfiler R包和KEGG进行了基因集富集分析（GSEA）
VEGFA对ADAMTS1表达和启动子活性的影响
使用定量实时PCR分析了Hep3B和Saos-2细胞系中ADAMTS1 mRNA的基线表达水平。如图1a所示，Hep3B细胞的ADAMTS1转录水平高于Saos-2细胞，尽管差异不具有统计学意义（p>0.05）。这一趋势表明ADAMTS1可能在肝脏来源的细胞中更活跃地表达，提示存在组织特异性的调控模式。这些发现为后续实验提供了参考
讨论
ADAMTS1是一种分泌型金属蛋白酶，在细胞外基质的动态重组中发挥作用。ADAMTS1对癌症的影响因环境和肿瘤类型而异；一些研究报道其促进肿瘤进展，而另一些研究则报告其具有肿瘤抑制作用（de Arao Tan等人，2013年）。针对HCC的研究显示ADAMTS1的表达低于正常肝组织。这种表达降低表明它可能
伦理批准
本研究未涉及动物或人类，因此不需要伦理批准。
资助声明与披露
本研究得到了TüB?TAK（项目编号110T961）的财政支持。
作者贡献声明
Nelin HACIO?LU：撰写——原始草稿、可视化、验证、监督、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析。Esra TOKAY：撰写——原始草稿、可视化、验证、监督、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析。Yasemin KALFA：方法学设计、数据分析。Kubilay GüNERHAN：方法学设计、数据分析。Merve KARAMAN：方法学设计、数据分析。Feyza Nur SAV：方法学设计、数据分析。Kübra Zehra KALAY：方法学设计、数据分析。
