《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Split Technology in CRISPR-Cas System for Precision Genome Manipulation and Diagnostics
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split CRISPR-Cas系统通过模块化分割Cas蛋白或核酸组分实现可控组装，解决传统系统的脱靶效应、递送限制及检测灵敏度问题，在精准基因编辑和生物传感中展现潜力。
高雅卿|云阳芳|张晶晶
中国南京大学化学与生物医学创新中心（ChemBIC）化学学院，生命科学分析化学国家重点实验室，南京210023
摘要
CRISPR-Cas系统从根本上改变了基因组编辑和分子诊断领域，但其潜力受到应用特定限制的制约——即在治疗效果编辑中存在脱靶效应和递送难题，在诊断和生物成像应用中则存在灵敏度不足、背景干扰高以及目标范围狭窄等问题。为此，研究人员开发了分裂型CRISPR-Cas技术，该技术将核心功能组件（如Cas蛋白或sgRNA）设计成两个或多个无活性的片段。这些模块只有在预定义条件下才能重新组装成活性复合体，从而实现对编辑和检测事件的高精度时空控制。本文系统总结了主要的分裂策略，包括基于蛋白质和核酸的分割方法，并详细阐述了它们的激活机制。此外，我们还重点介绍了分裂型CRISPR-Cas系统在提高诊断特异性和可编程性方面的新兴应用。最后，讨论了关键技术挑战，并展望了下一代分裂系统的开发方向。
引言
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）及其相关Cas蛋白最初在大肠杆菌基因组中被发现，这一发现彻底改变了基因工程领域[1]、[2]。该系统最初被描述为细菌和古菌的一种适应性免疫机制，它利用CRISPR衍生的RNA（crRNA）引导Cas核酸酶识别并切割入侵病毒DNA中的特定序列[3]、[4]。其核心组成部分包括：（1）Cas蛋白，负责执行靶向双链DNA切割[5]；（2）引导RNA（gRNA），通过20个核苷酸的间隔区赋予序列特异性，并与Cas蛋白形成复合体[6]；（3）短前间隔序列（PAM），对识别和切割启动至关重要[7]、[8]。这一可编程机制的阐明为其在真核细胞中的多功能基因组编辑应用奠定了基础[9]、[10]、[11]、[12]。
这一突破促进了具有不同特性的Cas蛋白簇的发现和开发，例如Cas12a和Cas13，它们在目标特异性（DNA vs. RNA）和切割活性方面存在差异[13]、[14]、[15]。CRISPR的基本基因切割能力迅速扩展为了一套复杂的工具，涵盖了碱基编辑[16]、[17]、启动子编辑[18]、转录激活/抑制（CRISPRa/i）[19]、表观遗传修饰[20]以及高级诊断平台（如SHERLOCK）[21]。CRISPR技术的革命性影响得到了国际认可，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna因此获得了2020年诺贝尔化学奖。
尽管CRISPR-Cas平台具有巨大潜力，但其精确度和适用性仍受到若干限制的制约，包括脱靶效应、持续的核酸酶活性、缺乏精确的时间控制以及多重编辑能力方面的挑战[18]、[22]。此外，载体的携带能力有限也影响了递送效率。例如，常用的腺相关病毒（AAV）的最大载量仅为4.7 kb，而像化脓性链球菌Cas9（SpCas9）这样的核酸酶体积较大（约4.2 kb），进一步增加了病毒递送的难度。在分子诊断和生物成像领域，性能通常受到其他因素的限制：未扩增检测的灵敏度受Cas酶动力学影响；目标范围主要局限于核酸；高保真度细胞成像受到信噪比低和背景干扰的挑战[23]。这些挑战推动了更可控、更安全的CRISPR平台的发展。
为克服这些限制，分裂型CRISPR-Cas系统作为一种创新的工程策略应运而生。该方法将关键组件（如Cas蛋白或核酸成分）分割成两个或多个无活性片段，只有在一个特定触发条件下才能重新组装成功能性复合体（图1）。这种设计实现了精确的时空控制，显著缩小了核酸酶活性的时间窗口和空间范围，从而提高了特异性并减少了脱靶效应和潜在毒性。分裂系统的模块化架构还便于实现布尔逻辑运算（例如AND门），进一步提升了复杂基因组干预的可编程性[14]。本文系统概述了分裂型CRISPR-Cas系统的主要设计策略和激活机制，强调了它们在生物传感和治疗领域的广泛应用，并讨论了该领域未来的发展方向。
CRISPR-Cas系统中的分割策略
“分裂”系统的基本概念是将一个功能性生物实体合理分割成两个或多个无活性模块。这些模块仅在暴露于特定触发因子时才能重新组装成活性复合体，从而恢复所需的功能。在CRISPR-Cas技术中，这一策略主要通过两种正交方法实现：分割Cas蛋白本身或分割其核酸引导成分。
Intein介导的剪接
Intein是一种自我剪接的蛋白质元件，能够在翻译后切除自身并将两侧的extein序列连接起来形成成熟的、具有功能的蛋白质[52]、[53]。在分裂型CRISPR系统中，Cas蛋白被分割成N端和C端片段，每个片段分别与一个intein的相应部分融合[54]。共同表达时，intein片段介导精确的蛋白质跨剪接，重新组装成完整的、有活性的Cas核酸酶。这一策略已被证明非常有效分裂型CRISPR-Cas系统的应用
分裂型CRISPR-Cas技术在分析和治疗领域展示了显著的应用潜力，这得益于其高度可控性、低背景信号和优异的适应性。功能组件的条件性重组实现了精确的时空调控，克服了传统CRISPR工具的脱靶效应、持续活性和递送限制等关键问题。以下部分总结了其主要应用分裂型CRISPR-Cas技术的主要挑战和未来发展方向
分裂型CRISPR-Cas技术在特异性、递送和时空控制方面具有显著优势，但其实际应用仍面临一些挑战。本节概述了主要挑战及可能的解决策略（表2）：结论
分裂型CRISPR-Cas技术是对传统CRISPR工具的重大改进，直接解决了长期以来在特异性、可控性和递送性方面的局限。通过将Cas蛋白或核酸引导成分分割成条件性重组的模块，该平台实现了对基因组编辑和分子检测的精确时空控制。多种分割策略（包括Intein介导的剪接、化学或光诱导的二聚化等）进一步增强了其应用潜力
CRediT作者贡献声明
张晶晶：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。云阳芳：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析、概念构思。高雅卿：初稿撰写、可视化处理、方法学设计、概念构思
竞争利益声明
? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2025YFC3409100）、江苏省自然科学基金（编号BK20242022）、国家自然科学基金（编号22574075）以及生命科学分析化学国家重点实验室（编号5431ZZXM2505）的支持。作者还感谢BioRender和PyMOL在提供图形元素方面的帮助。
