小反刍兽疫病毒（PPRV）通过上调IL-10调控山羊树突状细胞功能并诱导免疫抑制

《Virulence》：Peste des petits ruminants virus (PPRV) modulates caprine dendritic cell function and induces immunosuppression through IL-10 upregulation

本文深入探讨了小反刍兽疫病毒（PPRV）如何靶向并调控山羊树突状细胞（DC），揭示了其通过诱导IL-10高表达破坏DC-T细胞相互作用，从而介导宿主免疫抑制的关键机制，为理解该病毒致病性及设计干预策略提供了重要视角。

　　

引言

小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV，一种副粘病毒科麻疹病毒属病毒）引起的高度传染性疾病，影响绵羊和山羊，是世界动物卫生组织（WOAH）规定的须通报疾病。该病的一个显著特征是诱导宿主免疫抑制，导致机会性感染，增加动物死亡率。尽管山羊通常表现出比绵羊更严重的临床症状，但其背后物种特异性差异的机制尚不完全清楚。树突状细胞（DCs）是启动免疫反应的关键抗原呈递细胞（APCs），也是PPRV在小反刍动物中的免疫靶点之一。本研究旨在探究PPRV对山羊免疫细胞，特别是CD14⁺单核细胞和单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的影响，以阐明病毒介导免疫抑制的潜在机制。

材料与方法

本研究使用五只健康雄性Murciano-Granadina山羊，从外周血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。通过密度梯度离心和磁珠分选（MACS系统）富集CD14⁺单核细胞，并在添加绵羊GM-CSF和IL-4的培养基中培养72小时，诱导其分化为未成熟MoDC（iMoDC）。使用的PPRV毒株为强毒力Ivory Coast'89株系（I系）。细胞感染采用感染复数（MOI）为1。通过流式细胞术分析细胞表面标志物、胞内病毒蛋白（使用抗PPRV-N单克隆抗体）、细胞凋亡（Annexin V/7-AAD染色）和吞噬功能（荧光微球吞噬实验）。抗原呈递功能通过混合淋巴细胞反应（MLR）和共轭实验进行评估。利用定量PCR（qPCR）和多重细胞因子检测技术分析细胞因子表达。使用TLR7/8激动剂R848诱导MoDC成熟，并在共培养实验中使用抗IL-10阻断抗体探究IL-10的作用。统计学分析使用Prism 8.0软件进行。

山羊单核细胞来源树突状细胞的生成与表征

成功建立了生成功能性山羊MoDC的方案。从外周血分离的CD14⁺单核细胞在IL-4和GM-CSF存在下培养72小时后，分化成iMoDC。流式细胞术分析显示，与单核细胞相比，iMoDC上调了典型的DC表面标志物，包括CD209（DC-SIGN）、共刺激分子（CD80、CD86、CD40）、MHC-I、MHC-II、非经典MHC分子（CD1、CD1w2）以及整合素CD11c。形态学观察显示细胞变大，出现树突状突起。功能上，iMoDC表现出比单核细胞显著增强的吞噬微球能力。此外，经R848刺激成熟的MoDC（mMoDC）在MLR实验中能有效诱导同种异体CD4⁺和CD8⁺T细胞增殖，证实了其作为功能性抗原呈递细胞的能力。

PPRV感染CD14⁺单核细胞不影响其分化为iMoDC但损害其吞噬功能

研究发现PPRV可以感染CD14⁺单核细胞，感染后48小时可在细胞内检测到病毒N蛋白，但上清液中未检测到传染性病毒，表明这是一种非生产性感染。感染后的单核细胞仍能正常分化为iMoDC，其表面标志物表达谱与未感染对照组相似。然而，PPRV感染显著损害了分化后iMoDC的吞噬功能，表现为吞噬微球的细胞百分比和每个细胞吞噬的微球数量（几何平均荧光强度，Geo MFI）均降低。感染细胞还表现出共刺激分子CD80和CD40表达上调，而整合素CD11b和CD11c表达下调。

PPRV感染山羊iMoDC是非生产性的并诱导有限的凋亡

当iMoDC在培养48小时后感染PPRV，同样在细胞内检测到病毒蛋白，但未产生子代病毒，再次证实为非生产性感染。感染后24小时和48小时，细胞早期凋亡比例有所增加，但晚期凋亡无显著变化，细胞计数也无明显差异，表明PPRV仅诱导了轻微的凋亡反应。

PPRV感染增强山羊iMoDC的共刺激分子表达并降低其吞噬活性

PPRV感染的iMoDC表现出部分激活或成熟的表型。流式细胞术分析显示，与未感染对照组相比，感染细胞的共刺激分子CD80、CD86、CD40，整合素CD11c，以及非经典MHC分子CD1和CD1w2的表达均显著上调。然而，与R848诱导的成熟MoDC类似，PPRV感染的iMoDC其吞噬功能显著降低，这表明感染驱动了DC的活化，但这种活化是不完全的。

PPRV感染损害MoDC的抗原呈递能力

功能实验表明，PPRV感染严重损害了MoDC激活T细胞的能力。在异体MLR实验中，与未感染的成熟MoDC相比，PPRV感染的MoDC诱导CD4⁺和CD8⁺T细胞增殖的能力显著下降。在自体共培养系统中，使用超抗原SEB刺激，PPRV感染的成熟MoDC诱导CD4⁺T细胞产生干扰素-γ（IFN-γ）的能力也降低。Transwell实验表明，这种抑制效应是通过细胞直接接触和可溶性因子共同介导的。

PPRV感染损害DC-T细胞共轭形成并通过促进IL-10产生抑制T细胞活化

机制探究发现，PPRV感染显著降低了MoDC与自体免疫细胞形成稳定共轭（即免疫突触）的能力，这直接影响了抗原呈递的效率。细胞因子分析显示，PPRV感染的iMoDC中，促炎细胞因子基因（如TNF、IL6、CCL2）表达上调，而关键抗病毒细胞因子IFNA的表达被抑制。多重检测发现，感染DC的培养上清中IL-4、CCL4和IL-10的蛋白水平显著升高。其中，免疫抑制性细胞因子IL-10的上调尤为关键。流式细胞术进一步证实感染DC内IL-10蛋白表达增加。功能挽救实验表明，在共培养体系中加入抗IL-10阻断抗体，可以部分恢复PPRV感染的成熟MoDC对CD4⁺和CD8⁺T细胞增殖的抑制作用，直接证明了IL-10在此免疫抑制过程中的核心作用。

讨论

本研究首次全面描述了PPRV感染对山羊MoDC的影响，揭示了病毒如何调控其表型并损害其免疫功能。核心发现是PPRV感染导致MoDC中免疫抑制细胞因子IL-10的上调，这在其抑制宿主免疫反应中起关键作用。PPRV感染诱导MoDC部分成熟（表现为共刺激分子上调、吞噬功能下降），但同时又严重损害其抗原呈递能力，形成一种“异常成熟”状态。这种功能损害通过两种机制实现：一是破坏DC与T细胞之间的共轭形成，干扰免疫突触的建立；二是诱导产生以IL-10为代表的免疫调节性细胞因子，直接抑制T细胞活化。这种策略与其他麻疹病毒属成员（如麻疹病毒、犬瘟热病毒）的免疫逃逸机制相似。IL-10的上调、IFN-α信号的抑制以及共轭形成的障碍共同构成了PPRV多层次的免疫抑制策略，这很可能解释了在自然宿主感染中观察到的T细胞反应延迟现象。对PPRV在易感宿主（如山羊）中诱导免疫抑制机制的深入理解，有助于开发更有效的策略来控制这种新发跨境动物疫病。