基于大蜡螟感染模型的黄曲霉菌及其近缘种致病潜力研究：产毒能力、生长动力学与孢子尺寸对毒力的影响

《Virulence》：Virulence of Aspergillus flavus and relatives using the Galleria mellonella model

本研究利用大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型，系统评估了黄曲霉菌（Aspergillus flavus）及其近缘种的致病潜力。研究发现，所有黄曲霉菌株（临床与环境来源）均表现出高毒力，而产黄曲霉毒素菌株毒力更强。近缘种毒力普遍较低，且生长速度与孢子尺寸与毒力显著相关。结果强调了黄曲霉对人类健康的潜在风险，并验证了大蜡螟模型在比较毒力研究中的有效性。

　　

摘要

黄曲霉（Aspergillus flavus）因其作为主要黄曲霉毒素（aflatoxin）生产者和机会性人类病原体的双重角色，对人类健康具有重要影响。然而，其毒力机制尚不完全清楚。本研究利用大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型，评估了黄曲霉及其近缘种的致病潜力。研究纳入了26株黄曲霉分离株（临床和环境来源）和17株近缘种/驯化种。所有黄曲霉菌株均表现出高毒力，在感染后3天和7天内分别导致大蜡螟幼虫90%和100%的死亡率，且来源间无显著差异。产毒菌株毒力更高，在5天内导致100%死亡率（p < 0.05）。近缘种毒力较低，3天内幼虫死亡率在20%至70%之间，毒力排名为：黄曲霉 > 假诺米亚曲霉（A. pseudonomiae） > 寄生曲霉（A. parasiticus） > 诺米亚曲霉（A. nomiae） > 塔玛曲霉（A. tamarii） > 假空腔曲霉（A. pseudocaelatus）。生长动力学和孢子尺寸与毒力相关，快速生长和较小的孢子与更高的致病性相关。研究表明，黄曲霉比其近缘种具有更高的毒力，且生长速率和孢子尺寸是影响其致病性的因素。大蜡螟模型被证明是进行毒力比较研究的有效工具。这些发现强调了黄曲霉及其用于食品发酵的驯化近缘种的潜在健康风险，有必要对其致病潜力进行进一步研究。

引言

曲霉属（Aspergillus）包含339个公认物种，在环境中无处不在，其中一些对动物和人类健康有显著影响。在该属中，黄曲霉节（Aspergillus section Flavi）因其生态相关性和临床重要性而尤为引人注目。特别是黄曲霉，因其作为黄曲霉毒素的主要生产者和机会性人类病原体的双重角色，对人类健康具有重要意义。黄曲霉毒素是强致癌性和免疫抑制性化合物，污染全球食品供应。临床上，黄曲霉是仅次于烟曲霉（A. fumigatus）的第二大机会致病菌，可引起免疫功能低下患者的侵袭性曲霉病。然而，尽管黄曲霉具有临床重要性，其致病机制仍不完全清楚。大蜡螟幼虫作为一种替代毒力模型，因其能在37°C下生存、易于维护和操作以及伦理限制少而受到越来越多的关注。本研究旨在利用大蜡螟模型，比较产毒和非产毒黄曲霉菌株（及其驯化兄弟种米曲霉 A. oryzae）与相关物种（如塔玛曲霉、诺米亚曲霉、假诺米亚曲霉、假空腔曲霉、亚黄曲霉 A. subflavus 和寄生曲霉及其驯化兄弟种酱油曲霉 A. sojae）的毒力，并通过生长动力学和孢子尺寸测定，深入了解影响黄曲霉节物种致病性的因素。

材料与方法

菌株来源与分组

为评估不同来源黄曲霉菌株的毒力，研究共纳入26株黄曲霉分离株，包括15株临床菌株（10株来自苏丹，5株来自荷兰）和11株环境菌株。此外，还包括13株临床来源的近缘种和4株来自参考培养物的环境及驯化分离株（包括亚黄曲霉、米曲霉和酱油曲霉各一株及两株酱油曲霉）。所有分离株均在28°C的沙氏葡萄糖琼脂（SDA）上培养7天，并进行了分子鉴定和黄曲霉毒素谱分析。

分生孢子悬液制备与生存研究

从7天龄的SDA平板培养物中制备测试菌株的分生孢子悬液。接种剂量标准化为10³、10⁴和10⁵CFU/幼虫。实验设立阴性对照组（未触碰）、未感染对照组（注射PBS）和感染组（注射孢子悬液）。选用健康的六龄大蜡螟幼虫，每只感染组幼虫通过左后腹足注射20 μL孢子悬液。所有幼虫在36±1°C黑暗条件下每日监测7天，死亡定义为刺激后无运动。

感染验证：培养、直接镜检与组织病理学

收集感染组死亡幼虫的组织样本，在添加氯霉素的SDA平板上培养以确认真菌生长。同时进行直接显微镜检查观察真菌成分。感染后48小时的幼虫用10%缓冲福尔马林处死并固定，进行组织病理学分析，采用六胺银（GMS）染色观察真菌成分。

黄曲霉及其近缘种的表征

生长动力学

将7天龄培养物的孢子悬浮于0.1% Tween 20中，调整浓度至1×10⁵至 2.5×10⁵CFU/mL于RPMI 1640培养基中。在37°C下使用微孔板读数仪监测生长96小时，每30分钟记录一次620 nm处的光密度（OD）值。

孢子尺寸

从7天龄培养物中收获成熟分生孢子并悬浮。在显微镜下使用校准的目镜测微尺，随机测量每个分离株20个孢子的尺寸并计算平均值。

统计学分析

所有统计分析使用GraphPad Prism软件v9.5.0进行，显著性水平设为p < 0.05。使用log-rank (Mantel-Cox)检验比较生存曲线。进行相关分析评估生长参数与幼虫存活率之间的关系。使用单因素方差分析分析孢子尺寸的差异。

结果

黄曲霉及其近缘种在大蜡螟中的毒力

黄曲霉的毒力

孢子浓度对幼虫存活的影响呈浓度依赖性。随着浓度增加，存活率显著下降（p < 0.0001），在10⁵CFU/幼虫浓度下2天内导致100%死亡率。毒力测定的最佳浓度为10⁴CFU/幼虫，并用于所有后续实验。

所有黄曲霉分离株均表现出显著的致病性。来自苏丹的10株临床黄曲霉菌株在感染后6天内导致100%死亡率。同样，来自荷兰的4株临床黄曲霉菌株在7天内导致幼虫完全死亡。环境黄曲霉分离株也显示出强毒力，10株中有9株在6天内达到100%死亡率。在平均存活率上，临床与环境分离株之间无显著差异（p > 0.05）。然而，产毒菌株与非产毒菌株之间存在显著差异（*p < 0.05），无论是临床还是环境来源。

黄曲霉近缘种的毒力

黄曲霉节内的近缘种毒力低于黄曲霉。在黄曲霉导致85%幼虫3天内死亡的同时，其近缘种（塔玛曲霉、寄生曲霉、诺米亚曲霉、假诺米亚曲霉和假空腔曲霉）在同一时期的幼虫死亡率在20%至70%之间。此外，在寄生曲霉的两株产毒菌株和一株非产毒菌株之间未观察到显著差异（p > 0.05）。所有物种的毒力排名为：黄曲霉 > 假诺米亚曲霉 > 寄生曲霉 > 诺米亚曲霉 > 塔玛曲霉 > 假空腔曲霉，统计学分析证实这些差异显著（p < 0.05； p < 0.001； p < 0.0001）。

低毒或无毒的兄弟种米曲霉、酱油曲霉和亚黄曲霉表现出15%至90%的幼虫存活概率，与黄曲霉和寄生曲霉相比差异显著。

培养、直接镜检与组织病理学

图示了感染进程，健康大蜡螟幼虫呈乳白色身体，在死亡前逐渐黑化。死亡幼虫组织在28°C SDA上培养5天显示典型的黄绿色黄曲霉菌落。直接显微镜检查显示死亡黑化幼虫组织中广泛存在真菌成分，表明真菌全身性传播。光镜下可见密集的血细胞浸润和黑化斑块。使用GMS染色在感染后48小时的活体幼虫中，可见菌丝浸润和黑化的肉芽肿样结构（GLS）。

生长动力学与孢子尺寸

生长动力学与毒力

在96小时培养期间，观察到黄曲霉与其近缘种之间生长动力学的差异。黄曲霉在达到稳定期时的最终光密度（OD）值设为1，而假空腔曲霉则低于0.6。达到最大生长所需的时间与幼虫存活率呈正相关（r = 0.88）。

孢子尺寸与毒力

26株黄曲霉菌株的平均孢子尺寸在3.63 ± 0.29 至 5.41 ± 0.30 μm之间。只有三株黄曲霉分离株（2–2， 2–39， 和 CBS 542.69）的孢子尺寸超过5.00 μm。13株近缘种的平均孢子尺寸在4.65 ± 0.42 至 6.81 ± 0.45 μm之间，其平均孢子直径显著更大（p < 0.0001）；只有假诺米亚曲霉和诺米亚曲霉的各两株菌株小于5.00 μm。观察到孢子尺寸与幼虫存活率呈正相关（r = 0.78）。较大的孢子尺寸与较高的幼虫存活率相关。

讨论

本研究基于大蜡螟感染模型的综合分析，为黄曲霉及其在黄曲霉节中近缘种的致病潜力提供了新见解。我们评估了来自临床和环境的多种黄曲霉分离株，并检验了黄曲霉毒素产生在毒力中的潜在作用。我们的研究结果表明，无论来源和是否产毒，黄曲霉均表现出强致病性。组织病理学证据揭示了组织侵袭和全身性传播，强调了黄曲霉显著的感染潜力。该物种结合了快速的生长动力学和相对较小的孢子尺寸；这些参数与毒力增加呈正相关。黄曲霉与其近缘种之间的毒力存在显著差异（p < 0.001）。有趣的是，即使是黄曲霉的驯化兄弟种米曲霉也表现出一定程度的毒力，这与早期在小鼠模型中的观察结果一致。同样，寄生曲霉的驯化兄弟种酱油曲霉也表现出与其起源物种相当的毒力。

值得注意的是，在黄曲霉节的33个物种中，目前已知有16个物种能产生黄曲霉毒素，其中黄曲霉和寄生曲霉是最主要的产毒菌。然而，黄曲霉毒素的产生高度依赖于分离株，即使在单一物种内也可能不同。在我们的研究中，我们观察到十株产毒和十株非产毒黄曲霉分离株的毒力，发现产毒菌株的毒力显著高于非产毒菌株，在5天内导致100%幼虫死亡率（p < 0.05）。尽管我们的研究无法确认体内黄曲霉毒素的产生，但日本的报告记录了黄曲霉感染患者尸检组织中存在黄曲霉毒素。这些发现提供了该物种可在体内产生黄曲霉毒素的证据；然而，其对毒力的贡献仍知之甚少。作为强效免疫抑制剂，黄曲霉毒素已被证明能抑制吞噬作用、抑制氧化爆发、并降低宿主组织中的纤毛搏动频率（CBF）和一氧化氮（NO）产生，从而损害先天免疫反应。

根据我们的发现，黄曲霉毒素的产生似乎不是黄曲霉致病性的决定因素，因为一些非产毒菌株（例如1–13； E37）比某些产毒菌株（例如E2和E47）毒力更强。此外，在两株产毒和一株非产毒的寄生曲霉中，未发现显著差异（p > 0.05）。尽管包括黄曲霉毒素在内的次级代谢产物生物合成基因簇（BGCs）表现出群体特异性变异，但黄曲霉毒素产生特征可以出现在黄曲霉的多个种群谱系中。

尽管黄曲霉节物种之间亲缘关系密切，但观察到毒力存在显著差异（p < 0.001）。在我们的研究中，黄曲霉表现出最高的毒力，而其几个近缘种——包括诺米亚曲霉、塔玛曲霉和假空腔曲霉——在大蜡螟模型中表现出中度至低度毒力。驯化物种如米曲霉和酱油曲霉，虽然通常被认为是安全的（GRAS），但在大蜡螟模型中也表现出毒力，这与小鼠研究的结果一致。相比之下，亚黄曲霉表现出最小的毒力，7天内死亡率仅为5%。

除了真菌毒素产生，生长动力学和孢子尺寸等内在生物学特性似乎是影响毒力的重要因素。观察到黄曲霉快速进入对数生长期，而非致病物种亚黄曲霉在37°C下需要更多时间才能达到此阶段。关于孢子尺寸，我们的研究结果显示，孢子直径较小的黄曲霉分离株比其近缘种（包括塔玛曲霉、假空腔曲霉和寄生曲霉）毒力更强。这些结果表明，与黄曲霉节中的近缘种相比，黄曲霉较小的孢子尺寸可能有助于其在宿主定植和感染中获得竞争优势。孢子尺寸与毒力的相关性在物种内也是一致的，例如，孢子相对较大的黄曲霉菌株CBS 542.69毒力降低。

感染幼虫的组织学分析进一步支持了我们对毒力的观察。感染的幼虫表现出角质层的黑化。这种黑色素可能由微生物本身或宿主形成。密集的真菌菌丝浸润和肉芽肿样结构（GLS）在感染后48小时内形成。然而，与哺乳动物的肉芽肿不同，昆虫的肉芽肿样结构缺乏淋巴细胞这一适应性免疫的关键成分。

总之，本研究强调了黄曲霉毒力的多因素性质，由黄曲霉毒素产生、快速生长和小孢子尺寸共同驱动。鉴于存在这些相关性的例外情况，其他因素——如多种次级代谢产物的产生——也可能有所贡献。这些发现强调了研究物种特异性和分离株水平特征的重要性，以更好地理解黄曲霉及其在黄曲霉节中近缘种的致病潜力。