《Emerging Microbes & Infections》：Hypercoagulability and vascular proinflammatory activation promote cardiac-cerebral fibrinogenesis in a rodent model of Chagas Disease
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这篇综述性研究系统性探讨了慢性查加斯病（Chagas Disease, CD）中心脏与脑血栓并发症的形成机制。研究创新性地提出，持续的低水平克氏锥虫（Trypanosoma cruzi, Tc）感染，而非单纯由心肌病导致的血液瘀滞，是驱动心脑纤维蛋白生成的关键。通过验证Virchow血栓形成三要素（高凝、内皮功能紊乱、血流瘀滞）在该病模型中的作用，研究揭示了血小板激活、内皮细胞（EC）促炎/促栓表型转换及微胶质细胞激活是重要的病理环节。尤为重要的是，研究发现新型双顺反子免疫原（BCV/BCVR）可通过控制寄生虫负荷，有效减轻血管炎症和高凝状态，为预防CD相关血栓并发症提供了具有临床转化潜力的新免疫疗法。
研究背景与假说
心肌病和卒中是查加斯病（Chagas Disease, CD）的主要并发症，其中心脏和脑血管血栓事件的风险显著增高。传统观点认为，慢性CD中心肌病、心房颤动和左心室功能不全导致的血液瘀滞是血栓形成的关键驱动因素。然而，克氏锥虫（Trypanosoma cruzi, Tc）本身及其引发的炎症过程是否以及如何创造一个利于高凝和血栓形成的微环境，尚不完全清楚。基于Virchow血栓形成三要素理论——高凝状态、血管内皮功能障碍和血流改变，本研究提出假说：在CD中持续存在的低水平寄生虫和炎症过程，通过凝血级联与免疫细胞、内皮细胞的相互作用，共同促进了血栓的起始、进展和复发。
研究方法与模型
研究采用C57BL/6小鼠感染Tc（SylvioX10株）的模型，模拟人类CD的三个阶段：急性期（AT，感染后21-45天）、不确定期（IT，感染后可达6个月）和慢性期（CT，感染后6-9个月，出现心肌病和左心室功能障碍）。此外，研究设计并使用了两种双顺反子免疫原BCV和BCVR（后者添加了RIG-I激动剂佐剂），在感染前对小鼠进行免疫，以评估控制寄生虫负荷对血栓事件的影响。通过一系列先进的生化和分子技术，包括凝血因子活性检测、多重免疫荧光染色、Luminex多因子检测以及马休猩红蓝（MSB）染色评估纤维蛋白沉积，系统性地探究了Tc感染如何满足Virchow三要素，从而增加心脑血管血栓风险。
结果发现：高凝状态与止血功能紊乱
对小鼠血浆的分析揭示了CD病程中动态的止血功能紊乱。在急性期（AT）之后，不确定期（IT）和慢性期（CT）小鼠的血浆中，血小板激活标志物（P-选择素、血小板因子4 PF4、糖蛋白VI GPVI）水平显著升高，表明血小板被持续激活和聚集。同时，凝血级联的内源性途径（因子XII、IX/IXa）、外源性途径（组织因子TF/F3）及共同途径（凝血酶原F2/凝血酶F2a、纤维蛋白原F1、因子XIII/XIIIB）的水平和活性在IT-CT期也普遍升高。尽管抗凝血酶和纤溶系统成分（如纤溶酶原、纤溶酶、D-二聚体）也有所增加，但似乎不足以对抗强烈的促凝趋势。功能学检测（活化部分凝血活酶时间APTT、凝血酶原时间PT）缩短，国际标准化比值INR降低，均直接表明IT-CT期，特别是CT期小鼠的凝血能力增强，处于高凝状态。这些结果提示，Tc感染引发的损伤相关分子模式（DAMPs）和炎症分子，可能在IT期刺激了原发性（血小板）和继发性（凝血级联）止血功能紊乱，并在慢性期导致凝血时间缩短和血栓形成风险增高。
结果发现：心肌血管内皮的炎症与损伤
心肌血管内皮细胞（EC）是维持血管稳态、防止血栓形成的关键。研究发现，在CD进展过程中，心肌组织中CD31+内皮细胞的数量有所减少，但其呈现促炎（表达CCL2）和促栓（表达血管细胞粘附分子1 VCAM1）表型的比例在IT和CT期显著增加。虽然表达血管内皮生长因子VEGF和增殖标志物Ki67的“伤口愈合”型内皮细胞和血管平滑肌细胞（SMC）也有适度增加，但不足以补偿因炎症导致的EC损失。心肌血管平滑肌细胞的数量没有变化，表明血管新生（neo-vessel formation）在进展期CD中不太可能发生。对心脏血管的蛋白多因子分析进一步证实，促炎细胞因子（如IFNγ、IL1β）、趋化因子（如CCL2、CCL3、CCL5）以及促栓因子IL6在IT和CT期显著上调。这些发现表明，持续的低水平Tc感染在心肌中维持了一个内皮细胞促炎/促栓表型转换的反馈环路，破坏了内皮的抗血栓功能，为心血管系统血栓形成创造了条件。
结果发现：大脑中的神经炎症与血管激活
研究还深入探究了CD中的脑血管病理。大脑中IBA1+/CD68+的小胶质细胞/巨噬细胞在IT和CT期增多，并且产生IL6的促炎性小胶质细胞比例显著升高。小胶质细胞的激活似乎早于脑血管的炎症反应。大脑血管内皮细胞（EC）虽然数量未变，但表达VCAM1、尿激酶型纤溶酶原激活物uPA（与轴突生长/突触修复相关）以及促炎因子CCL2和IL6的比例在感染后期（尤其是CT期）增加。这表明，Tc感染可能破坏了血脑屏障（BBB），小胶质细胞释放的IL6等因子激活了脑血管内皮，形成了一个小胶质细胞-内皮细胞的炎症反馈循环，共同导致了神经炎症和促栓微环境的形成。
结果发现：新型免疫疗法BCV/BCVR的效果
为探索治疗干预的可能性，研究测试了新型双顺反子免疫原BCV和BCVR的疗效。这两种免疫原能在感染前显著降低小鼠心脏和大脑中的寄生虫负荷。更重要的是，BCV/BCVR治疗能有效减轻心脏和大脑血管的促炎/促栓反应。在血浆水平，治疗显著降低了血小板活化标志物、多种凝血因子活性以及纤溶系统成分，并改善了APTT和PT，使INR恢复正常，从而缓解了高凝状态。其中，添加了佐剂的BCVR效果通常优于BCV。
结果发现：心脑纤维蛋白生成的时间进程
通过MSB染色直接观察组织中的纤维蛋白沉积，研究发现纤维蛋白在心脏中的沉积从AT期就开始出现，并持续存在于IT和CT期。相比之下，大脑中显著的纤维蛋白沉积直到CT期才被检测到。BCV/BCVR治疗能有效减少心脏和大脑中的纤维蛋白沉积。这一差异可能与Tc主要在心肌复制，早期即导致心脏血管内皮功能障碍和炎症有关；而大脑因有血脑屏障保护，其血管病理和纤维蛋白生成需要更长时间的炎症累积，在慢性期才变得明显。
结论与意义
本研究系统性地阐明了Tc感染如何通过协同驱动高凝状态、血管内皮功能障碍和促炎激活，满足Virchow血栓形成三要素，从而促进CD心脑纤维蛋白生成和血栓并发症。关键发现是，持续的低水平寄生虫感染（及相关的DAMPs）是主要的驱动因素，而非继发于心肌病的血液瘀滞。这改变了以往对CD血栓病因的认识。研究首次详细描绘了血小板、内皮细胞和小胶质细胞在CD血栓-炎症网络中的关键作用及动态变化。此外，研究开发的BCV/BCVR免疫原展现出通过控制病原、从源头上减轻血管炎症和高凝状态、预防纤维蛋白沉积的潜力，为研发预防CD相关卒中及血栓并发症的新型免疫治疗策略提供了重要的临床前依据和新的思路。
