《Animal Cells and Systems》：ATP release mediated by TRPM3 enhances invasion in glioblastoma
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本研究发现，在胶质母细胞瘤（GBM）中，机械刺激（MS）能够诱导ATP的释放，这一过程依赖于瞬时受体电位M3（TRPM3）通道，且不依赖于细胞内外的Ca2?信号。通过基因敲降技术证实，TRPM3介导的ATP释放是GBM细胞侵袭行为的关键驱动因素。该研究揭示了肿瘤微环境中机械力如何通过一种非经典的信号通路促进癌症进展，并指出了一个潜在的新型治疗靶点，为抑制GBM的侵袭扩散提供了新思路。
引言
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见、最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，被世界卫生组织（WHO）定为4级。即使采用包括手术切除、替莫唑胺化疗和放射治疗在内的综合疗法，患者的中位生存期仍不足一年，预后极差。其最具破坏性的特征之一是其对周围正常脑组织的广泛侵袭，这导致治疗失败和高复发率。由于颅腔空间有限，GBM的增殖和侵袭会导致颅内压（ICP）升高，而升高的颅内压已被证明是驱动肿瘤进展的关键因素之一。
在肿瘤微环境（TME）中，多种细胞外信号分子调节着肿瘤的生长和扩散。其中，三磷酸腺苷（ATP）作为一种重要的信号分子备受关注。在包括GBM在内的多种肿瘤中，细胞外ATP水平显著高于正常组织（可达100–500 μM），并且与肿瘤的转移和侵袭有关。ATP可以通过多种途径释放，包括胞吐作用、半通道、容量调节性阴离子通道（VRAC）、细胞死亡过程以及P2X7受体介导的释放等。
有趣的是，机械刺激（MS）在肿瘤微环境中普遍存在，并可能与肿瘤进展相关，但其诱导ATP释放的分子机制尚不明确。瞬时受体电位（TRP）通道超家族是已知的机械敏感离子通道，能够响应拉伸或压缩等机械力，启动胞内信号级联反应。该家族中的TRPM（M亚型）成员，特别是TRPM3、TRPM7和TRPM8，在GBM患者中高表达，并与患者预后相关。这些发现提示，TRPM通道可能在介导机械刺激诱导的ATP释放中扮演重要角色。
本研究旨在探究机械刺激是否以及如何诱导GBM细胞释放ATP，并阐明其潜在的分子机制和生物学功能。研究发现了一种不依赖于Ca2?的新型ATP释放通路，并确定了TRPM3在这一过程中的核心作用及其在促进GBM细胞侵袭中的功能。
材料与方法
本研究采用了多种细胞模型，包括人源胶质母细胞瘤细胞系U-87 MG、U-373 MG以及患者来源的GBM原代细胞（pdGBM）。核心实验方法如下：
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ATP成像：使用荧光传感器蛋白GRABATP1.0对ATP释放进行实时动态监测。通过显微镜操控玻璃微管对单个细胞施加可控的机械刺激，并记录其引起的荧光强度变化。
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Ca2?成像：利用Fura-2 AM染料监测细胞内Ca2?浓度变化，以评估机械刺激是否通过Ca2?依赖途径引发ATP释放。实验中使用了Ca2?螯合剂EGTA的Ca2?游离缓冲液以及内质网Ca2?泵抑制剂毒胡萝卜素（TG）来分别耗竭胞外和胞内Ca2?。
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基因沉默与病毒包装：设计并合成了针对TRPM3、TRPM7和TRPM8的短发夹RNA（shRNA），通过慢病毒载体系统转导至GBM细胞中，以敲降相应基因的表达。通过qRT-PCR验证了敲降效率。
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嗅探膜片钳技术：将表达工程化P2X2-V343Q受体（一种对ATP高度敏感的离子通道）的HEK293T细胞与GBM细胞共培养。当机械刺激诱导GBM细胞释放ATP时，ATP会激活邻近HEK293T细胞上的P2X2-V343Q通道，从而产生可记录的内向电流。这种方法提供了ATP释放的直接电生理学证据。
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功能学分析：通过伤口愈合实验评估细胞迁移能力；利用Transwell小室结合Vitrogel水凝胶基质进行三维侵袭实验，评估细胞的侵袭能力。此外，还分析了外加ATP对细胞侵袭的影响。
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生物信息学分析：利用人脑胶质瘤图谱计划（IVY-GAP）数据库分析TRPM3、TRPM7和TRPM8在不同肿瘤区域的表达谱。通过癌症基因组图谱（TCGA）等多个公共数据集，分析TRPM3基因改变状态与GBM患者总生存期的关联。
结果
- 1.
机械刺激（MS）诱导GBM细胞释放ATP：研究首先证实，在U-87 MG细胞中，通过微管施加的MS能够引发显著的ATP释放，而G蛋白偶联受体（GPCR）激动剂TFLLR则不能诱导类似的ATP释放。这一现象在后续的嗅探膜片钳实验中也得到了独立验证，即机械刺激GBM细胞会在邻近的“嗅探”细胞中记录到ATP激活的内向电流，进一步确认了ATP的释放。
- 2.
MS诱导的ATP释放是非Ca2?依赖性的：一个关键的发现是，这种ATP释放不依赖于细胞内外的Ca2?。即使在胞外Ca2?被螯合（使用EGTA），并且内质网内的Ca2?被耗尽（使用TG）的条件下，MS仍然能够诱导ATP释放。此外，实验还发现ATP释放的程度与机械刺激的强度（通过微管电阻变化衡量）并无显著相关性。
- 3.
TRPM3是介导MS诱导ATP释放的关键通道：通过药理学筛选，研究者发现广谱TRP通道抑制剂2-APB能完全阻断MS诱导的ATP释放，而TRPA1特异性抑制剂HC-030031只能部分抑制，TRPC和TRPV通道的抑制剂则无明显效果。这提示可能是2-APB敏感的其他通道在起作用。随后，研究者将目光聚焦于TRPM亚家族。通过基因敲降实验发现，敲降TRPM3能显著抑制U-87 MG、U-373 MG以及患者来源GBM细胞中MS诱导的ATP释放。而敲降TRPM7或TRPM8则无此效果，证明了TRPM3在介导此过程中的特异性。
- 4.
TRPM3通过释放ATP促进GBM细胞侵袭：功能实验表明，敲降TRPM3虽未显著影响U-87 MG细胞的迁移能力，但能显著降低其侵袭能力。相反，对敲降TRPM3的细胞给予外源性ATP处理，则能逆转其侵袭能力的下降，这直接表明ATP的减少是侵袭抑制的关键。同时，生物信息学分析显示，在临床样本中，TRPM3的表达在肿瘤侵袭前沿区域（leading edge和infiltrating tumor）显著富集，并且TRPM3基因发生改变的GBM患者预后更差，进一步支持了TRPM3在GBM侵袭中的临床相关性。
讨论
本研究揭示了一个新的、不依赖于Ca2?的机械力信号转导通路：在GBM细胞中，机械刺激通过激活TRPM3通道，诱导ATP释放到肿瘤微环境中，从而促进肿瘤细胞的侵袭行为。这一发现拓展了我们对TRPM3功能的认识，它不仅是传统的Ca2?通透性通道，还是一个介导机械刺激响应的ATP释放通道。
研究结果具有多重意义。首先，它为理解颅内压升高如何促进GBM进展提供了潜在的分子机制——颅内压作为一种机械力，可能通过激活肿瘤细胞中的TRPM3，引发ATP释放，进而驱动侵袭。其次，研究明确了TRPM3是这一过程的关键分子，使其成为一个有前景的抗侵袭治疗靶点。针对TRPM3开发抑制剂，可能在不影响传统Ca2?信号通路的情况下，特异性地阻断这种由机械力驱动的促侵袭信号。
释放到微环境中的ATP可以以自分泌或旁分泌方式发挥作用。它可以直接作用于肿瘤细胞自身（如激活P2X7受体，导致Ca2?内流），或作用于微环境中的其他细胞，如肿瘤相关巨噬细胞、小胶质细胞或神经元，从而重塑肿瘤微环境，间接促进肿瘤生长和侵袭。这形成了一个复杂的正反馈网络。此外，本研究排除了其他已知的ATP释放通路（如Cx43、VRAC、P2X7）在本实验条件下是主要机制的可能性，强调了TRPM3通路的独特性。
研究的局限性在于，当前的体外模型可能无法完全复现体内肿瘤微环境的复杂性。未来研究需要在更贴近生理条件的模型（如类器官、原位模型）中验证这一机制，并深入探究TRPM3释放的ATP如何影响微环境中其他细胞的行为，以及微环境如何反过来调节TRPM3的活性。
总之，本研究阐明了GBM中一种由TRPM3介导、不依赖Ca2?的机械力-ATP信号轴，它连接了肿瘤的物理微环境（压力）与生物学侵袭行为。这一发现为开发针对GBM侵袭过程的新型靶向疗法提供了理论依据和新的研究方向。
