《Autophagy》：Phase separation of OPTN initiates mitophagy to orchestrate craniofacial bone mineralization
OPTN相分离启动线粒体自噬以协调颅颌面骨矿化
绪论
颅颌面畸形，如下颌后缩和腭裂，是最常见且严重的先天性缺陷之一，常伴有骨骼发育缺陷和骨矿化不良。颅颌面骨发育依赖于间充质干细胞成骨分化的膜内成骨过程。近期证据凸显了无定形磷酸钙（ACP）前体在生物矿化中的作用，并揭示了一种涉及线粒体介导的细胞外矿化的替代机制。然而，这种由间充质干细胞驱动的细胞外矿化途径是否促进颅颌面骨发育尚不清楚。
线粒体自噬由自噬受体介导，其中OPTN作为关键受体参与多种自噬过程。OPTN功能丧失与骨代谢紊乱密切相关，包括Paget骨病（PDB），而颅颌面受累是该疾病的一个公认特征。但OPTN在早期颅颌面发育中的具体作用仍未明确。机制上，OPTN功能丧失通过自噬非依赖途径（如增强NF-κB激活）促进破骨细胞生成。另有证据表明，OPTN以自噬依赖的方式增强骨髓间充质干细胞的成骨分化。虽然OPTN因其在自噬中的多种作用而受到广泛关注，但其在颅颌面发育过程中介导线粒体自噬的分子机制仍知之甚少。
液-液相分离（LLPS）最近被提出是细胞自组织的基本物理化学机制，能够浓缩生物分子以促进各种生化过程。这一现象通常由两种分子驱动力驱动：蛋白质中的内在无序区域（IDRs）和多价相互作用。越来越多的证据表明LLPS参与自噬的调控，提示其在组织自噬机制和介导货物时空隔离中的作用。值得注意的是，经典的自噬受体如SQSTM1/p62通过与多聚泛素的多价相互作用经历LLPS，形成胞质凝聚物。OPTN与SQSTM1具有显著的结构和功能同源性，这表明OPTN可能在颅颌面骨发育过程中通过LLPS在线粒体自噬介导的ACP转移中发挥潜在作用。
理解细胞内ACP转移过程对于理解骨发育和病理性骨矿化的机制至关重要。我们的研究揭示了一个先前未被认识的机制，即OPTN LLPS协调线粒体自噬和ACP转移，从而深刻影响骨矿化和颅颌面发育。这一过程受到两种翻译后修饰（PTMs）的精细调控：磷酸化和泛素化。
结果
1. OPTN介导的线粒体自噬参与OMSCs的成骨和矿化
先前研究已确定，间充质干细胞中的线粒体自噬可由ACP的积累触发，从而启动ACP在细胞质细胞器间的运输及其随后的胞吐作用，进而促进骨形成和矿化。为确定线粒体自噬是否介导口颌面骨间充质干细胞（OMSCs）的骨矿化，我们在标准培养基和成骨分化培养基（ODM）中培养这些细胞，并通过透射电子显微镜（TEM）和定量实时PCR（qRT-PCR）评估线粒体自噬水平。结果揭示了在成骨分化过程中，线粒体自噬通量增加，电子致密颗粒的传递以及自噬相关基因（Map1lc3/Lc3、Becn1、Optn）表达上调。此外，碱性磷酸酶（ALP）和茜素红（ARS）染色表明，羰基氰氯苯腙（CCCP）诱导的线粒体自噬促进了成骨矿化，而巴弗洛霉素A1（Baf-A1）抑制的线粒体自噬则减少了矿化。
OPTN是参与线粒体自噬的关键自噬受体，在骨骼发育和骨重塑中发挥重要作用。OPTN功能障碍与骨代谢紊乱（包括PDB）密切相关。鉴于在PDB患者中观察到的颅颌面畸形，我们开发了optn基因敲除小鼠模型，以研究OPTN介导的线粒体自噬在颅颌面发育中的作用。出生后第21天（P21）的显微CT分析显示，这些小鼠的颅骨（顶骨、下颌骨和腭骨）矿化减少。出生后第1天（P1）的骨骼染色表明，optn-/-小鼠的顶骨和顶间骨矿物质沉积减少，并伴有下颌后缩。钙黄绿素双标记进一步表明，OPTN的缺失显著降低了矿物沉积率（MAR）、骨表面矿化面积（MS/BS）和骨形成率（BFR/BS），表明矿化活动受损。此外，通过冯库萨、马松三色和总胶原蛋白染色，在optn-/-小鼠中观察到更少的钙沉积和新骨形成。
为了阐明潜在机制，我们在体内和体外评估了线粒体自噬和成骨活性。Mito-QC报告基因显示optn-/-小鼠的线粒体自噬通量大幅减少。OMSCs中的ALP和mtKeima测定证实，OPTN缺乏显著损害了体外成骨潜能和线粒体自噬通量。在分子水平上，下颌切片的免疫组织化学（IHC）显示成骨标志物（RUNX2、OPN、OCN）表达减少，而蛋白质印迹分析证实了在下颌组织和OMSCs中的类似减少。同时，IHC和蛋白质印迹分析都证明了线粒体自噬缺陷和异常的线粒体积累。
我们进一步检查了矿化和线粒体自噬过程中OPTN的时空动力学。在未矿化状态下，OPTN表现为细胞质点状。在矿化诱导下，它聚集成球形液滴，ODM+CCCP组表现出更多更大的液滴。此外，在矿化诱导下，与吞噬泡（由LC3标记）或线粒体（由MitoTracker标记）共定位的OPTN液滴数量显著增加，特别是在ODM+CCCP组中。这些观察结果表明，OPTN可能在线粒体自噬和矿化过程中发生LLPS。
2. OPTN在线粒体自噬或矿化过程中发生LLPS
为了评估OPTN的相分离潜力，我们进行了生物信息学分析。MetaDisorder预测其NTD中存在具有低序列复杂度的IDRs。ProtParam显示IDR富含带电残基，包括谷氨酸、赖氨酸和丝氨酸。PhaSePred进一步表明具有高相分离倾向。
我们通过在CCCP处理的293T细胞中表达EGFP-OPTN来研究OPTN斑点是否在线粒体自噬期间显示液体样特性。在此条件下，球形EGFP-OPTN液滴在细胞质中形成。荧光漂白后恢复（FRAP）测定显示，漂白后90秒内荧光迅速恢复，表明与周围细胞质的动态交换。使用光敏液滴测定，我们将OPTN与mCherry-Cry2融合，实现光诱导的蛋白质浓缩和液滴形成。Opto-OPTN形成动态簇，FRAP分析显示荧光快速恢复。F?rster共振能量转移（FRET）分析显示，在CCCP诱导的线粒体自噬过程中，EGFP-OPTN和mCherry-OPTN之间的能量转移随时间增加。FRET效率的升高表明分子间距离减小和OPTN寡聚化增强，提示OPTN在线粒体自噬过程中发生显著聚集。活细胞成像显示，CCCP诱导导致小的OPTN液滴聚集成更大的液滴，在CCCP去除后这些液滴又重新分散。用1，6-己二醇（1，6HD）处理导致液滴溶解，但在1，6HD去除后它们重新形成。此外，FRAP实验证明，OPTN在H2O2诱导的氧化应激条件下也表现出LLPS能力。这一发现意味着OPTN LLPS是对多种类型细胞压力的响应机制。
我们随后通过进行体外LLPS测定来验证OPTN的LLPS特性。使用纯化的重组EGFP-OPTN蛋白质在不同浓度的NaCl和蛋白质条件下观察EGFP阳性液滴的形成和行为。OPTN的LLPS因低盐和高蛋白质浓度而加速。添加拥挤剂PEG8000显著增强了液滴形成。值得注意的是，FRAP证实了这些液滴的动态性质。这表明OPTN在体外表现出相分离能力，其相分离行为受NaCl浓度、蛋白质浓度和拥挤剂的影响。
为了阐明OPTN蛋白在矿化微环境中的作用，本研究将这些实验发现扩展到OMSCs中进行验证。在ODM中培养的optn敲除OMSCs中，转染的EGFP-OPTN形成球形液滴，并在光漂白后表现出荧光恢复。这支持了OPTN液滴在OMSCs矿化过程中的液体样性质，与报道的LLPS凝聚物的特征行为一致。这些发现表明OPTN在活细胞和体外均发生LLPS。
为了研究LLPS对线粒体自噬和成骨矿化的影响，LC3标记的吞噬泡与线粒体的荧光共定位以及ALP测定显示，CCCP诱导的LLPS促进了线粒体自噬和矿化。相反，1，6HD对LLPS的抑制损害了这两个过程。总之，这些证明了OPTN经历LLPS来调控线粒体自噬和矿化。
3. NTD和CTD对于OPTN的LLPS是必需的
我们分析了OPTN的结构域，以确定负责LLPS的关键结构域。OPTN的NTD包含一个IDR，如PONDR数据库所预测。CTD含有一个参与线粒体自噬的泛素结合结构域（UBD）。
因此，我们构建并转染了两个截短片段：mCherry标记的OPTN-NTD和OPTN-CTD到293T细胞中，以检查它们的LLPS特性。在CCCP诱导下，OPTN-NTD和OPTN-CTD都在转染的细胞中形成许多球形液滴，这些液滴在FRAP测定中表现出荧光恢复。值得注意的是，OPTN-CTD显示出更强的相分离倾向，表现为更高比例的液滴形成细胞和更高的荧光恢复率。FRAP分析进一步证实，NTD和CTD液滴在氧化应激条件下保留了LLPS能力。此外，活细胞成像证明，NTD和CTD衍生的液滴都能够发生融合事件，突出了它们的液体样行为。
随后，EGFP标记的OPTN-NTD和OPTN-CTD被纯化，并在不同蛋白质和NaCl浓度下进行体外液滴形成测定，模拟全长OPTN的条件。两个截短片段都表现出形成液体液滴的能力。添加10% PEG8000诱导了液体液滴向聚集体的转变。这些结果强调了NTD和CTD在OPTN LLPS中的重要作用。小鼠OPTN的NTD和CTD在OMSCs矿化过程中的相分离能力也通过FRAP实验得到证实。因此，由OPTN蛋白的NTD和CTD驱动的相分离可能在矿化微环境中起关键作用。
4. OPTN LLPS受NTD S173位点的磷酸化和CTD D474位点的泛素链依赖性修饰调控
为了识别CCCP诱导的线粒体自噬过程中OPTN凝聚物的组成，我们在转染了TurboID-mCherry-OPTN的293T细胞中使用了生物素邻近标记和质谱分析。通过比较对照组和CCCP处理组的质谱数据，我们确定了在CCCP诱导条件下OPTN蛋白质凝聚物中特异性富集的蛋白质。总共检测到1440种蛋白质，其中991种与线粒体自噬相关。进一步的筛选揭示了24种差异表达蛋白质，它们与OPTN蛋白的相互作用在CCCP处理后发生了显著变化。将这些结果与已知的线粒体自噬相关蛋白质进行交叉比对，突出了可靠的OPTN伴侣。在鉴定的蛋白质中，STK4因其与线粒体自噬的高度相关性而被选中。STK4先前已被报道通过调节磷酸化事件来增强线粒体自噬。然而，其与OPTN的相互作用尚不清楚。使用免疫荧光染色和免疫共沉淀测定，本研究证实STK4在细胞质中与OPTN蛋白共定位并直接相互作用。用STK4抑制剂XMU-MP-1处理显著降低了OPTN丝氨酸残基的磷酸化水平。FRAP分析进一步表明，XMU处理抑制了OPTN的流动性。免疫荧光和ALP测定表明，XMU显著抑制OMSCs的线粒体自噬和成骨能力。
我们通过磷酸化质谱进一步鉴定了STK4在OPTN上的特异性磷酸化位点，确定丝氨酸173为关键磷酸化位点。鉴于S173位于NTD，我们假设STK4通过此位点促进OPTN-NTD相分离。为了验证这一点，我们构建了OPTN-NTD-S173A突变体以防止S173的磷酸化，并将其与野生型OPTN-NTD一起在OPTN敲除的293T细胞中表达。S173A突变和XMU处理均导致磷酸化水平降低。FRAP分析显示，S173A突变损害了OPTN-NTD相分离。此外，OPTN-NTD和OPTN-NTD-S173A突变体在XMU处理后无法形成相分离的液滴。用λ蛋白磷酸酶处理也显著抑制了OPTN-NTD和OPTN-FL的LLPS，表明磷酸化促进了OPTN相分离。这些结果表明，STK4通过特异性磷酸化其NTD内的S173来触发OPTN相分离。
OPTN-CTD区域包含一个与多聚泛素链特异性相互作用的UBD。由于具有多价串联结构域的多聚泛素链驱动LLPS，我们假设这些多价相互作用增强了OPTN LLPS并支持线粒体自噬。为了验证，我们将EGFP-Ub与各种OPTN片段（包括OPTN-FL、OPTN-CTD、OPTN-NTD、OPTN-CTD-D474N）共转染到OPTN KO 293T细胞中。泛素增强了OPTN-FL和OPTN-CTD中OPTN液滴的流动性，表现为更高的荧光恢复率。在OPTN-CTD-D474N中，泛素部分共定位，可能是由于UBD功能不完全。未共定位的OPTN-CTD-D474N液滴在漂白后没有恢复。在OPTN-NTD组中，液滴的80秒荧光恢复率不受泛素添加的影响。为了进一步研究泛素对OPTN体外LLPS的影响，我们将EGFP-OPTN-FL与纯化的mCherry标记的线性泛素链在不同浓度下孵育。更高的泛素链水平显著促进了LLPS液滴的形成。使用此浓度，我们观察到泛素链强烈促进了EGFP-OPTN-FL和EGFP-OPTN-CTD的LLPS，但对EGFP-OPTN-NTD或突变体EGFP-OPTN-CTD-D474N则没有。这些结果表明，泛素化通过CTD介导的多价相互作用促进OPTN LLPS。
5. NTD-S173磷酸化和CTD-D474泛素化驱动的LLPS调控线粒体自噬和矿化
值得注意的是，延时成像直接捕捉到了OPTN LLPS液滴在线粒体上动态招募吞噬泡的实时动态过程。这为OPTN凝聚物与线粒体吞噬泡形成的共存提供了直接的视觉证据。鉴于OPTN包含一个具有LC3-II结合LIR基序的NTD和一个能够结合泛素的CTD——这两者对于线粒体自噬都是必需的，我们试图剖析由这些结构域介导的LLPS对自噬过程的贡献。为此，我们将EGFP-Ub或EGFP-LC3与不同mCherry标记的人OPTN构建体共转染到OPTN KO 293T细胞中。
我们首先通过检查OPTN凝聚物与EGFP-Ub的重叠来评估泛素结合。OPTN-FL和OPTN-CTD与EGFP-Ub完全共定位，而OPTN-CTD-D474N仅显示部分重叠，OPTN-NTD和OPTN-NTD-S173A则没有。这些结果表明，CTD介导的LLPS对于线粒体自噬过程中UBD依赖的泛素识别至关重要，其中D474残基起关键作用。我们接下来分析了线粒体关联。OPTN-FL和OPTN-CTD与线粒体强烈共定位，这与它们的泛素识别模式一致，而OPTN-CTD-D474N显示出受损的重叠。OPTN-NTD和OPTN-NTD-S173A均不与线粒体关联。
为了评估吞噬泡的参与，我们评估了与LC3的重叠。OPTN-FL和OPTN-NTD液滴与EGFP-LC3强烈关联，但这种相互作用在NTD-S173A突变体中被破坏。OPTN-CTD与LC3有中等程度的重叠，这在D474N突变体中几乎被消除。这些结果表明，由S173调控的NTD驱动的LLPS促进了LC3簇集和吞噬泡组装，而CTD残基D474通过稳定凝聚物间接支持了这一过程。最后，我们通过评估溶酶体关联来检查自噬清除。OPTN-FL与溶酶体强烈共定位，而NTD-S173A和CTD-D474N突变体则没有。单独的OPTN-NTD和OPTN-CTD显示部分重叠，表明存在残留的自噬通量。总之，线粒体自噬测定表明，由CTD-D474泛素化介导的LLPS能够实现货物识别，而由NTD-S173磷酸化调控的LLPS则驱动LC3依赖的吞噬泡成熟，从而协调高效的自噬体-溶酶体融合和清除。
为了测试这些机制是否通过线粒体自噬调控成骨矿化，我们将EGFP标记的小鼠OPTN构建体转染到OPTN缺陷的OMSCs中。ALP和ARS测定显示，与全长构建体相比，NTD和CTD的矿化减少，而NTD-S183A和CTD-D477N突变体的矿化减少更甚。总之，这些发现确定，由NTD-S183磷酸化和CTD-D477泛素化介导的LLPS促进了OMSCs中的成骨矿化。
我们进一步研究了OPTN LLPS调控矿化的信号通路和分子机制。将CCCP诱导的OPTN邻近相互作用组数据与OPTN缺陷干细胞在矿化条件下的转录组数据整合，确定了SLC6A15是唯一一个显著富集且发生转录改变的基因。SLC6A15编码一个中性氨基酸转运蛋白，提示其在矿化过程中的代谢调节作用。此外，KEGG通路富集分析显示，OPTN敲低后钙信号通路显著富集。这一转录谱表明，OPTN的缺失扰乱了成骨矿化所必需的代谢稳态和钙转运。
6. Optn LLPS促进线粒体自噬和矿化以调控斑马鱼的颅颌面发育
OPTN在脊椎动物中高度保守。利用能够进行实时成像和基因操作的斑马鱼模型，我们在体内验证了Optn LLPS在骨矿化和发育中的作用。在发育阶段，Optn蛋白在斑马鱼头部形成液滴。FRAP数据表明Optn发生LLPS。我们观察到，在用二甲氧基甘氨酸（DMOG，一种在斑马鱼中已验证的线粒体自噬诱导剂）诱导线粒体自噬后，斑马鱼中Optn液滴的数量及其与LysoTracker的共定位增加。相反，添加1，6HD抑制了这种现象。在120小时后，颅颌面软骨的阿利新蓝染色显示中碱性区与酸性区（B:A）的比率降低，提示DMOG+1，6HD组存在下颌后缩。受精后第10天的钙黄绿素染色表明，DMOG的应用促进了斑马鱼的矿化和钙沉积。相比之下，DMOG+1，6HD组的骨矿化受到抑制。
为了进一步研究optn介导的线粒体自噬对斑马鱼矿化的影响，我们通过注射靶向optn的反义吗啉寡核苷酸创建了optn敲低斑马鱼胚胎。optn MO显著增加了斑马鱼的畸形率，并诱导了幼虫的下颌后缩。
随后，本研究采用转基因自噬报告斑马鱼系进一步评估optn敲除对自噬的影响。在该系统中，EGFP-mCherry双荧光系统用于标记LC3蛋白。结果显示，在optn MO转基因斑马鱼组中，黄色和红色信号减弱，表明自噬通量降低。map1lc3b的mRNA水平也证实了这些发现。此外，ARS和钙黄绿素染色表明optn MO组斑马鱼的钙沉积较少。成骨标志物mRNA水平的降低进一步支持了这一结论。
我们前面的部分已经表明，S173介导的磷酸化和D474N介导的泛素化是影响Optn相分离的关键因素。由于这些残基在人类和斑马鱼之间是保守的，我们进一步研究了等效残基S140和D411在斑马鱼骨矿化和发育中的作用。我们将optn FL mRNA、optn S140A mRNA和optn D411N mRNA注射到optn敲低斑马鱼中。注射构建体的斑马鱼畸形率显著高于对照组。qRT-PCR实验表明，optn FL mRNA有效挽救了因optn敲低导致的线粒体自噬和成骨缺陷，而optn S140A和D411N mRNA仅提供了减弱的挽救。我们使用转基因斑马鱼来标记成骨细胞，并用ARS评估成骨分化和矿化。Optn敲低减少了sp7阳性成骨细胞面积和矿物质沉积，而optn FL mRNA在很大程度上恢复了这些缺陷，S140A和D411N mRNA仅提供了不完全的恢复。受精后第10天的钙黄绿素染色和受精后第27天的显微CT进一步证实了optn及其突变体对后期发育阶段颅颌面骨矿化的影响。综上所述，这些发现表明，由NTD磷酸化和CTD泛素化调控的OPTN LLPS是颅颌面骨发育中的一个保守机制。
讨论
颅颌面发育主要通过膜内成骨方式塑造，涉及骨髓间充质干细胞向成骨细胞和骨细胞分化的骨形成模式。最近的研究揭示了一种补充途径，即间充质干细胞通过线粒体自噬介导的矿化促进骨形成，但它是否以及如何促进颅颌面骨发育仍然未知。在这里，我们证明OPTN是一种参与线粒体自噬的自噬受体，经历LLPS，促进其NTD与吞噬泡以及其CTD与泛素链的相互作用。因此，OPTN作为一个枢纽，将受损的线粒体拴系到吞噬泡，使ACP能够递送到细胞外基质。此外，我们证实了S173或D474的突变会破坏凝聚物与吞噬泡或线粒体的共定位。通过使用基因敲除小鼠和斑马鱼模型，我们最终确定破坏OPTN驱动的LLPS和线粒体自噬会导致颅颌面矿化缺陷。
颅颌面发育异常包括形态学和矿化缺陷，严重损害面部美观和功能。许多遗传综合征具有突出的颅颌面畸形，通常与异常的骨骼矿化相关。例如，由I型胶原蛋白基因突变引起的成骨不全症，其特征是额部隆起和牙本质发育不全，伴有骨密度低和矿化不良。同样，与PHEX基因突变相关的低磷性佝偻病，由于磷酸盐代谢紊乱，表现为颅缝早闭和釉质发育不全。虽然先前的研究主要集中在颅颌面发育的基因突变和大体形态异常上，但控制矿化的分子机制在很大程度上仍然未知。在生物矿化过程中，我们的结果解决了一个长期存在的难题，即自噬受体如何协调如此多样的信号，以准确地将受损线粒体连接到吞噬泡以实现ACP释放。早期的研究表明，泛素链用“吃掉我”标签标记受损的线粒体，该标签被OPTN特异性识别，招募自噬效应物如LC3以启动线粒体降解。最近的研究揭示了OPTN凝聚物在泛素化表面上的生物物理特性，其中液相形成通过毛细管力和润湿效应增强了线粒体-吞噬泡相互作用。我们的研究强调，OPTN的泛素结合和LLPS都是吞噬泡形成和有效执行线粒体自噬的关键前提。
多价相互作用是LLPS的主要分子驱动力之一。在线粒体自噬的LLPS调控背景下，泛素链不仅充当降解信号，还扮演着额外的关键角色：它们的多价串联结构促进了相分离凝聚物的形成。在这项研究中，泛素链显著增强了OPTN相分离凝聚物的流动性。与其结构同源的蛋白质SQSTM1不同，OPTN能够在体外自发进行LLPS，这种能力在存在泛素链的情况下进一步增强。值得注意的是，OPTN的UBD内的人D474N突变破坏了泛素链结合，导致相分离能力大幅下降。该突变与破骨细胞分化增加和PDB密切相关，这表明受损的相分离可能是某些骨骼发育障碍的关键分子机制。
IDR介导的多价性是蛋白质相分离的关键决定因素。截短实验表明，缺乏CTD片段的OPTN-NTD仍然表现出荧光恢复。由于NTD包含广泛的IDR片段，这表明除了泛素链介导的多价相互作用外，IDR本身可以独立促进OPTN LLPS并有助于线粒体自噬的调控。这突显了OPTN相分离受多价相互作用和IDR结构域的双重影响。为了进一步阐明IDR介导的OPTN相分离的调控机制，本研究首次鉴定并验证了丝氨酸/苏氨酸激酶STK4作为OPTN相分离凝聚物的关键相互作用伙伴。经典理论描述，STK4主要通过磷酸化BNIP3来调节线粒体自噬，这是一种独立于经典PINK1-PRKN/Parkin信号的途径。然而，我们的研究揭示了一种新的调控模式：STK4通过磷酸化促进OPTN LLPS，从而以非经典方式间接调节PINK1-PRKN介导的线粒体自噬。磷酸化修饰向蛋白质引入负电荷，增强静电相互作用并促进相分离。STK4特异性磷酸化OPTN的S173残基，在N端的IDR区域引入负电荷。这种修饰增强了与带正电的卷曲螺旋结构域的静电相互作用，促进多聚体组装，并最终驱动相分离过程。这一机制为理解线粒体自噬的复杂调控网络提供了新的见解。
失调的相分离最近已成为由疾病相关突变或翻译后修饰驱动的致病机制。在癌症中，致癌突变利用异常的LLPS促进肿瘤发生，刺激了治疗探索。然而，针对发育性骨骼疾病的类似策略仍然不发达。我们的研究通过识别OPTN相分离中的两个关键调控位点：S173和D474，分别受磷酸化和泛素化调控，来填补这一空白。这两个位点在人类、小鼠和斑马鱼中进化保守，强调了它们的功能重要性。D474先前已被认为与PDB相关，而S173是一个我们系统地验证了其调控机制的新位点。功能测定表明，S173A和D474N突变损害矿化，建立了一个将基
