《Connective Tissue Research》：Nutrient deprivation of tendon-derived cells and its effect on collagen matrix integrity – mimicking graft remodelling after ACL reconstruction in vitro running title: cell starvation vs collagen integrity
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本文通過構建體外肌腱模型，探討了前十字韌帶（ACL）重建後，移植體所處的營養匱乏環境對其中肌腱衍生細胞活力及膠原基質完整性的影響。研究發現，極端營養缺乏雖導致細胞活力下降，但並未誘導細胞轉向分解代謝狀態或損害基質機械性能，提示移植體術後力學性能下降可能並非主要由其內源性細胞的直接破壞作用導致。
引言
前十字韌帶（ACL）撕裂是常見的運動損傷，ACL重建手術是恢復活動能力的金標準。然而，移植體（無論是自體還是異體肌腱）在術後會經歷力學性能的快速下降，且永遠無法恢復到原生ACL的水平。這可能與移植體早期重塑所處的挑戰性環境有關。手術中，移植體被切斷血液供應，並因關節沖洗而失去滑液的營養支持，導致嚴重的營養缺乏。這種環境如何影響移植體內的細胞及其在組織重塑中的作用尚不清楚。本研究旨在通過體外模型，評估營養缺乏對細胞誘導的組織完整性喪失的影響。
移植體早期癒合階段伴隨著力學性能下降和細胞活力喪失。動物研究和人體活檢均顯示移植體核心存在大量細胞壞死。同時，炎症細胞積聚伴隨著高水平的基質金屬蛋白酶（MMP，膠原降解酶）。這些因素被認為驅動了膠原的分解和結構紊亂。另一個早期事件是駐留細胞活力的下降。營養匱乏的環境以及死細胞與活細胞的共存，可能促使細胞轉向分解代謝狀態或促進分解代謝環境，從而加劇移植體完整性的喪失。然而，在體內直接研究移植體駐留細胞對重塑過程的貢獻十分困難。因此，本研究利用體外肌腱模型，假設營養缺乏會導致肌腱衍生細胞轉向分解代謝狀態，通過釋放和/或激活MMP而負面影響基質完整性。
材料與方法
研究從大鼠尾部提取肌腱衍生細胞（RTDCs），並將其嵌入大鼠尾I型膠原凝膠中，使用Flexcell系統構建肌腱模型。首先，所有模型在標準條件下培養一天，建立基準組。隨後，將培養基更換為四種不同的實驗組培養基，繼續培養7天：
- 1.
完全培養基組：5 mM葡萄糖，2.5%胎牛血清。
- 2.
輕度營養缺乏組：0.5 mM葡萄糖，無血清。
- 3.
極端營養缺乏組：0 mM葡萄糖，無血清。
- 4.
冷凍組：0 mM葡萄糖，無血清，並經歷三次凍融循環以模擬異體移植物的處理。
研究評估了各組模型的細胞活力（通過活/死染色和乳酸脫氫酶LDH活性）、機械性能（彈性模量、破壞應力、破壞應變）、膠原纖維排列以及MMP（MMP8和MMP2）的分泌與活性。
結果
細胞活力隨營養缺乏而下降
在完全培養基組和輕度營養缺乏組中，細胞活力保持穩定且無顯著差異。在極端營養缺乏組中，細胞活力顯著下降。經過冷凍處理後，死細胞比例和LDH活性均顯著增加。
細胞收縮與營養缺乏條件相關
與基準組相比，完全培養基組的肌腱模型寬度顯著減小，表明細胞持續收縮。從完全培養基組到冷凍組，模型寬度呈現逐漸增加的趨勢。冷凍組的模型寬度顯著大於其他所有組。
膠原排列未受環境條件顯著影響
各實驗組之間的膠原纖維排列強度未發現顯著差異，即各組膠原纖維具有同等強度的排列。
力學性能僅在完全培養基組得到改善
完全培養基組表現出顯著更高的彈性模量和破壞應力（強度），而所有營養缺乏組和冷凍組的力學性能與基準組相比均未發生顯著改變（既未改善也未惡化）。所有實驗組的破壞應變均顯著低於基準組。
營養缺乏並未增加MMP的量與活性
在所有組中均檢測到了潛在型、酶原型和活性型MMP8（膠原酶-2）及MMP2（明膠酶A）。僅在完全培養基條件下，活性MMP2的量顯著高於其他所有組。活性MMP8的量從完全培養基組到冷凍組逐漸減少，完全培養基組與冷凍組之間存在顯著差異。這表明營養缺乏並未導致MMP分泌的顯著增加。
討論
本研究的主要發現是，即使在極端營養缺乏條件下，體外膠原模型中的肌腱衍生細胞既未轉向分解代謝狀態，也沒有改善或惡化模型的完整性。因此，肌腱移植體駐留細胞對模型完整性的直接影響可能並非體內移植體退化的主要原因。
在完全培養基條件下，細胞活力高，模型發生收縮，機械性能（彈性模量和強度）提高。這種機械性能的改善可能源於細胞收縮驅動的膠原纖維橫向聚集和連接增強，而非新膠原的合成。同時檢測到的MMP活性可能參與了局部的膠原纖維降解與重組過程，即“應力穩定”機制，優先降解未對齊、未受張力的膠原纖維。
令人驚訝的是，當細胞僅能獲得極少量營養（輕度缺乏）時，其活力與完全培養基條件相當，這與肌腱細胞本已生活在缺氧的無血管環境中的生理特性相符。肌腱細胞可能在營養缺乏時降低其活性以維持生存。然而，營養缺乏剝奪了細胞施加收縮力的能力，從而阻止了進一步的模型收縮和力學性能的改善。
冷凍處理導致模型寬度增加，可能是由於冰晶形成造成了膠原纖維群的分离。有趣的是，儘管細胞活力顯著下降，但營養缺乏組和冷凍組的機械完整性讀數並無差異，且MMP活性未見增加，這確認了細胞並未轉向分解代謝狀態並負面影響模型力學。活細胞無法在營養匱乏的環境中產生或激活MMP，可能因為它們缺乏所需的能量。這些存活細胞可能處於一種靜息但活躍的狀態，儲存能量以用於招募外在區室的細胞（如來自滑膜或骨隧道的細胞），而這可能是術後體內MMP水平升高的觸發因素。
結論
本研究通過體外模型系統揭示，肌腱衍生細胞在營養缺乏的條件下並未對膠原模型的完整性產生負面影響。這表明ACL重建後移植體力學性能的早期下降，可能並非主要由其內源性駐留細胞的直接分解代謝活動導致。然而，這些細胞也未能主動重塑其周圍的細胞外基質以改善機械性能。這凸顯了肌腱細胞在惡劣環境中維持組織結構的頑強韌性，同時也將研究的焦點引向其他可能影響移植體命運的因素，如外在細胞的募集、免疫反應以及力學負荷的作用。該發現對於理解移植體重塑的生物學過程和探索改善ACL重建效果的策略具有重要意義。
