《Gut Microbes》：Responses of intestinal organoids to infection byMycobacterium aviumresemble symptoms observed in Crohn’s disease
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本研究通过建立小鼠小肠类器官（mSIO）感染模型，揭示了鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）感染引发的早期宿主免疫反应与克罗恩病（CD）之间的潜在关联。文章采用高分辨率成像与转录组学分析，结合巨噬细胞共培养，证实感染可驱动与CD相似的炎症基因特征（如TNF-α/NF-κB通路），并识别出MMP7为感染与病理改变之间的潜在分子桥梁。
引言
克罗恩病（CD）是一种慢性、复发性炎症性肠病（IBD），其发病机制与宿主-微生物相互作用密切相关。鸟分枝杆菌复合体（MAC）是动物肠道重要病原体，其中副结核分枝杆菌（MAP）会导致反刍动物约内氏病（JD），其病理特征与CD有相似之处，但鸟分枝杆菌感染与CD发病间的因果关系及早期上皮细胞反应尚不清楚。近年，肠道类器官作为一种具有生理相关性的三维（3D）培养模型，为研究肠道生物学和宿主-病原体相互作用提供了强大工具。本研究旨在建立小鼠小肠类器官（mSIO）鸟分枝杆菌感染模型，以评估其诱导的炎症反应是否与CD相关，并探索潜在的分子机制。
材料与方法
类器官培养与感染：小鼠小肠类器官（mSIO）在基底膜提取物（BME）和ENR培养基中培养，并每周传代。实验中，使用表达mWasabi荧光蛋白的鸟分枝杆菌Chester株（ATCC? 700898?）感染类器官，感染剂量为每孔约10个mSIO接种105CFU细菌，并通过共聚焦显微镜（CLSM）进行活细胞成像观察。
巨噬细胞共培养：将RAW 264.7巨噬细胞用CellTracker? CM-DiI染色后，与预先感染鸟分枝杆菌的mSIO共培养，置于玻璃底96孔板中，观察免疫细胞行为。部分实验中，使用TLR2抑制剂MMG-11和CU-CPT22预处理巨噬细胞，以探究TLR2信号通路的作用。
连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）：用于高分辨率观察感染后类器官的内部超微结构及细菌的亚细胞定位。
转录组学分析：收集感染后24小时的mSIO和未感染对照，提取总RNA进行RNA测序（RNA-seq）。数据使用CLC Genomics Workbench进行比对和分析，通过Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）鉴定富集通路。同时，与已发表的克罗恩病人源粪菌移植（FMT）小鼠（BioProject PRJNA980747）转录组数据进行对比分析。
分子生物学验证：通过实时定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光染色，对RNA-seq中发现的差异表达基因MMP7在mRNA和蛋白水平进行验证。
统计分析：使用GraphPad Prism软件进行，数据以均值±标准误表示。正态分布数据采用未配对双尾t检验，P值<0.05视为具有统计学显著性。
结果
小鼠小肠类器官鸟分枝杆菌感染模型的建立
成功培养并建立了mSIO感染模型。通过共聚焦显微镜动态观察发现，感染后24小时，约75%的类器官被成功感染，且细菌负荷随时间推移而增加。有趣的是，未感染的mSIO会向微注射到Matrigel中的鸟分枝杆菌方向发生定向移动 。鬼笔环肽染色和SBF-SEM高分辨率成像进一步证实，鸟分枝杆菌能在感染24小时后定位于mSIO的细胞内部 。SBF-SEM图像甚至捕捉到细胞从基底侧以吞噬作用样方式摄取鸟分枝杆菌的过程。
鸟分枝杆菌感染驱动巨噬细胞向mSIO募集
在mSIO与巨噬细胞共培养体系中，观察到巨噬细胞随时间推移，向被感染的mSIO迁移并聚集在其周围，模拟了肉芽肿形成早期的免疫细胞募集事件 。当使用TLR2抑制剂预处理巨噬细胞后，其向感染mSIO迁移的轨迹长度和平均速度均显著降低，表明TLR2信号通路参与了这一过程。
转录组分析揭示感染mSIO中的炎症基因特征
RNA-seq分析显示，与未感染对照组相比，感染组有1690个基因上调，1404个基因下调。主成分分析（PCA）显示两组样本明显分离。GSEA分析表明，感染显著富集了多个促炎症通路，其中TNF-α信号通过NF-κB通路富集程度最高，其他还包括炎症反应、IL-6/JAK/STAT3信号、补体激活、上皮-间质转化（EMT）等 。此外，感染导致肠道干细胞和瞬时扩增细胞标记基因下调，而肠细胞、潘氏细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞标记基因上调。
比较转录组分析支持与CD相关炎症的重叠
将本研究的感染mSIO转录组数据与CD患者粪菌移植小鼠的公开数据集进行比较，发现两者在差异表达基因上存在显著重叠，与近端结肠（CD-PC）重叠最多。通路富集分析显示，两者共同显著富集了多个炎症相关通路，包括干扰素反应、IL-6/JAK/STAT3信号和补体反应等。特别是，两者都显著富集了“炎症性肠病（IBD）信号通路” 。
MMP7是感染mSIO和CD小鼠模型中共享的炎症标志物
在感染mSIO中上调最显著的基因之一是Mmp7（基质金属蛋白酶7），其在CD粪菌移植小鼠的近端结肠中也持续上调。qRT-PCR和蛋白质印迹实验分别在mRNA和蛋白水平验证了MMP7在感染mSIO中的表达上调。免疫荧光染色显示，MMP7蛋白在感染mSIO的上皮层有强定位 。这些结果表明，MMP7是连接鸟分枝杆菌感染与CD样炎症的潜在保守分子标志物。
讨论
本研究成功建立了一个mSIO鸟分枝杆菌感染模型，证实了鸟分枝杆菌能够入侵并在类器官细胞内定殖。共培养实验揭示了巨噬细胞向感染灶的TLR2依赖性趋化行为，模拟了早期肉芽肿形成。转录组学分析表明，感染引发了强烈的促炎症反应和上皮重塑，其基因特征与CD患者粪菌移植小鼠模型高度相似。特别值得注意的是，MMP7在两种系统中均被一致上调。MMP7已知可降解紧密连接蛋白Claudin-7，破坏上皮屏障，并在IBD患者的炎症上皮细胞中高表达，提示它可能是感染驱动黏膜损伤的关键介质。
该模型也存在一些局限性，例如仅模拟了急性感染、共培养系统缺乏T细胞等其他免疫细胞、使用的是野生型小鼠类器官等。未来的研究可以引入慢性感染模型、纳入CD相关基因突变、以及使用人源类器官和免疫细胞共培养系统，以更好地模拟人类疾病的复杂性，并进一步探究鸟分枝杆菌在CD发病中究竟是触发因素、促进因素还是旁观者。
