一种新型肠道细菌Enterocloster sp. M3通过合成致癌物苯乙烯驱动结直肠癌发生

《Gut Microbes》：Novel bacterium Enterocloster sp. M3 promotes colorectal tumorigenesis via the production of the carcinogen styrene

本文首次报道了从腺瘤患者中成功分离出的携带m3基因标记的肠道细菌M3（一种与Enterocloster aldenensis亲缘相近但表型、基因组和功能均存在显著差异的新型菌株），并通过动物实验、细胞实验及代谢组学等系列研究，系统揭示了M3通过合成致癌物苯乙烯(styrene)等多种肿瘤促进性代谢物，促进结直肠肿瘤发生的关键机制。研究发现，苯乙烯在CRC患者粪便中显著升高，且在小鼠肠道中的暴露量超过WHO安全限值。尤为重要的是，研究首次阐明了M3体内合成苯乙烯的分子途径，鉴定出两个关键酶——天冬氨酸氨裂合酶(AAL)和尿卟啉原脱羧酶(UROD)，为后续开发靶向干预策略奠定了重要基础，也为肠道菌群在肿瘤发生中的作用提供了崭新视角。

　　

M3的分离与鉴定

研究采用针对m3基因标记的富集培养策略，成功从一名73岁结肠腺瘤女性的样本中分离出M3菌株。通过16S rDNA分析、全基因组测序、MALDI生物分型以及表型特征分析，发现M3与Enterocloster aldenensis在系统发育上关系密切，平均核苷酸同一性(ANI)达98.5%，但在多个方面存在明显差异。M3细胞形态更小，碳源利用谱不同，且最关键的是，完全不含m3 DNA序列。基于这些独特的遗传和表型特征，研究提出M3属于Enterocloster属，可能代表E. aldenensis的一个新菌株。

M3促进小鼠结肠肿瘤发生

通过向Apc^Min/+小鼠和偶氮甲烷(AOM)处理的野生型小鼠灌胃M3，研究发现M3能显著增加结肠肿瘤的发生率和大小，其促瘤效果强于E. aldenensis对照菌株。组织学检查显示，M3处理组小鼠结肠组织的异常增生和癌症发生率最高。定量PCR(qPCR)结果表明，M3处理的Apc^Min/+小鼠粪便中M3丰度逐渐增加，并且在终点时与肿瘤数量和大小呈正相关。这些结果表明，肠道菌群中的M3直接介导了促肿瘤效应。

M3分泌的代谢物促进结肠细胞、肿瘤移植物及肠类器官生长

研究表明，M3培养上清液中的非蛋白组分是发挥其致癌作用的关键介质。该上清液能够显著增强多种结肠癌细胞系以及永生化的结肠上皮细胞系NCM460的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力。在皮下异种移植瘤模型中，瘤内注射M3上清液也显著加速了肿瘤生长。值得注意的是，M3上清液还能刺激正常人类肠道类器官的扩增，表明M3通过分泌功能性代谢物介导其致癌作用。

M3通过失调宿主基因表达促进细胞增殖并损害DNA修复

RNA测序(RNA-seq)分析发现，与大肠杆菌(E. coli)处理相比，M3上清液处理的结肠癌细胞中，参与DNA损伤反应、DNA修复和G₁-S期细胞周期调控的基因显著失调。流式细胞术分析显示，M3上清液加速了细胞的G₁-S期转换，同时细胞周期抑制剂p21表达降低，而G₁-S期进程的关键调节因子CDK6、cyclin D1和磷酸化RB1的表达增加。Ki-67染色进一步证实，M3处理增加了未分化类器官中的增殖细胞比例。参与DNA修复和细胞周期停滞的关键基因Chk1被显著下调。蛋白质印迹和免疫组化一致显示，在M3处理后，结肠癌细胞、非肿瘤小鼠结肠组织和人类肠道类器官中，Chk1的磷酸化活化形式(pChk1)均显著下调。这些发现表明，M3代谢物通过加速细胞周期进程和抑制DNA修复来发挥致癌作用。

非靶向与靶向代谢组学鉴定出M3产生的潜在致癌代谢物，尤其是苯乙烯

非靶向液相色谱-质谱联用(LC-MS)代谢组学分析显示，与对照培养基相比，M3上清液中有39种代谢物增加，76种减少。在增加的代谢物中，有8种特别值得关注：三种已知致癌物，包括苯乙烯(styrene)、2,6-二甲基苯胺和2-氨基萘；三种在CRC患者粪便中先前报道升高的潜在致癌代谢物，即鹅去氧胆酸、正缬氨酸和焦谷氨酸；以及两种可能与苯乙烯相关的代谢物，即苯乙醛和4-羟基苯乙烯。其中，苯乙烯及其两种衍生物以及2,6-二甲基苯胺位列增幅最大的前十大代谢物之中。靶向LC/GC-MS验证证实，与对照（E. coli、E. aldenensis和肉汤）相比，M3上清液中苯乙烯、2,6-二甲基苯胺和焦谷氨酸的含量显著增加。KEGG通路分析显示，M3上清液中与酪氨酸和苯丙氨酸代谢相关的代谢物总体减少，而与苯乙烯降解通路相关的代谢物总体增加，进一步支持了苯乙烯的存在。

M3处理小鼠粪便中肿瘤促进性代谢物升高，其中苯乙烯尤为突出

提取M3处理小鼠粪便中的代谢物进行体外细胞培养发现，这些代谢物同样能显著促进结肠癌细胞和NCM460上皮细胞的增殖。随后的非靶向代谢组学分析在M3处理小鼠的粪便中鉴定出25种增加和18种减少的代谢物，其中苯乙烯、苯乙醛、焦谷氨酸和尿嘧啶这四种代谢物在M3培养上清液和小鼠粪便中均升高。除了苯乙醛，苯乙烯的另外两种下游代谢物苯乙胺和扁桃酸在M3处理小鼠的粪便中也升高。优化的靶向气相色谱-质谱联用(GC-MS)定量分析证实，M3处理小鼠粪便中的苯乙烯水平显著高于对照组。按小鼠体重和粪便量推算，M3处理组小鼠平均每日苯乙烯暴露量达到12.5 μg/kg体重，超过了世界卫生组织(WHO)为人类设定的每日可耐受摄入量(7.7 μg/kg)。更重要的是，粪便中苯乙烯水平与M3丰度呈正相关。这些发现表明，M3在体内产生了具有生物学相关水平的苯乙烯。

人结直肠癌患者粪便代谢物中的苯乙烯水平显著升高

研究分析了来自晚发型（≥50岁）和早发型（<50岁）CRC患者及其年龄匹配的对照者的粪便样本的LC-MS非靶向代谢组学数据。结果发现，苯乙烯及其下游代谢物苯乙醛在晚发型和早发型CRC患者的粪便中均显著升高。其中，苯乙烯最为突出，在晚发型和早发型CRC患者中分别较对照组增加了2.72倍和3.13倍。这表明肠道菌群衍生的苯乙烯可能参与了人类结直肠癌的发生。

M3中苯乙烯生物合成的酶学系统是首次报道的细菌苯乙烯生产途径

作为在M3培养物和M3处理小鼠粪便中均发现的最突出的代谢物，苯乙烯是以前未报道过的细菌产物。KEGG通路分析追踪了细菌利用饮食蛋白质和糖类通过多种途径（酪氨酸代谢、莽草酸途径生物碱合成、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成）合成苯丙氨酸的过程。已知某些真菌可通过苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)和反式肉桂酸脱羧酶(FDC)将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸(tCA)进而转化为苯乙烯，但这一过程在细菌中未见报道。

蛋白质组学和基因组学分析表明，M3拥有从蛋白质和糖类合成苯丙氨酸所需的所有8种酶。尽管这些酶与E. aldenensis对应酶序列同源性超过99%，但关键酶酪氨酸酚裂解酶在M3中的丰度高出250倍以上。尽管M3缺乏典型的PAL和FDC酶，但其PAL样活性和tCA转化为苯乙烯的活性显著高于E. aldenensis和E. coli，提示M3中存在功能类似物。

新发现的酶AAL和UROD介导M3中苯乙烯合成的关键步骤

通过整合蛋白质组学和全基因组数据，研究确定了M3中负责将苯丙氨酸转化为苯乙烯的酶。在PAL同工酶中，只有天冬氨酸氨裂合酶(AAL)在M3中的表达高于E. aldenensis。尽管M3-AAL与其同源的乳酸杆菌(L. paracasei) AAL序列相似性仅为55.6%，但保留了相同的功能域。在候选脱羧酶中，尿卟啉原脱羧酶(UROD)被确定为tCA转化为苯乙烯酶的最主要候选者，其在M3中的表达水平显著高于E. aldenensis。重组M3-AAL表现出较高的PAL样活性，而其催化基序中的氨基酸序列被打乱后，该活性显著降低。同样，重组M3-UROD能高效催化tCA转化为苯乙烯，而在Arg29和其他乙酸酯定位位点的突变则显著削弱了这一活性。重要的是，从M3处理小鼠粪便中提取的蛋白质显示PAL样活性显著升高，且该活性与粪便中M3的丰度呈正相关。这些结果共同阐明了M3首次报道的细菌苯乙烯合成的分子基础。