《Gut Microbes》：Induction of DNA-mediated immune responses by bacterial extracellular vesicles results in control of murine norovirus infection
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本综述揭示了肠道共生菌来源的胞外囊泡（bEVs）通过其携带的DNA激活宿主细胞内DNA感知通路（如STING和TLR9），诱导I型干扰素（IFN）产生，从而有效抑制小鼠诺如病毒（MNV）复制的新机制。这为理解肠道菌群（microbiome）调控肠道病毒感染提供了全新视角，并提示bEVs在抗病毒免疫治疗和疫苗开发中的潜在价值。
文章内容归纳总结：
ABSTRACT
共生菌在调控病毒复制中扮演着关键角色，其对肠道病毒感染的调节机制因病毒和细菌种类而异。研究表明，共生菌产生的胞外囊泡（bEVs）能够抑制诺如病毒感染。本研究利用小鼠诺如病毒（MNV），探究了细菌胞外囊泡诱导的免疫学机制。全局基因表达分析指向胞质DNA通路被诱导激活；因此，我们评估了bEVs中包装的DNA含量以及激活I型干扰素（IFN）的DNA感知通路，包括STING和TLR9。结果显示，在bEVs存在的情况下，sting或tlr9基因的缺失会显著降低IFNβ的产生并恢复MNV的复制。这些数据共同证明，某些革兰氏阴性菌的bEVs能够启动抗病毒的DNA介导的I型IFN产生通路，而这些通路参与了抑制MNV复制的过程。这些发现揭示了本地微生物群帮助宿主控制肠道病毒感染的新机制，并为研究宿主与微生物群之间的跨界相互作用提供了新的视角。
Introduction
细菌来源的胞外囊泡（bEVs）已成为微生物学研究的关键要素，并为宿主-微生物相互作用提供了丰富的见解。所有细菌都会通过各种生物发生途径产生bEVs，这些途径因细菌种类和生长条件而异。革兰氏阴性菌bEVs的尺寸通常在25至250纳米之间，可以携带来自母体细菌的多种功能性成分，包括脂多糖（LPS）、磷脂、DNA和/或RNA。因此，病原菌和共生菌的bEVs都能够通过各种途径进行免疫调节。
共生菌调节迄今为止研究的所有肠道病毒感染，包括诺如病毒。先前的研究表明，诺如病毒会附着在共生菌上，这种附着会导致基因表达发生变化，从而对细菌细胞产生代谢和功能影响。这种相互作用导致的其中一个变化是共生菌增加了bEV的产生。有趣的是，用MNV感染小鼠也会导致粪便中bEV浓度增加，表明bEVs在病毒感染期间肠道中具有生物学功能。进一步支持这一假设的是，对来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的bEVs对MNV体外复制影响的研究表明，它们都能通过启动抗病毒反应来抑制病毒复制。除了抑制MNV复制，bEVs还能在体外和离体抑制流感病毒的复制，并控制RNA和DNA病毒的系统性复制。
尽管具有抑制病毒复制的共同能力，但bEV控制病毒感染的机制因靶向的病毒和所涉及的bEVs而异。例如，来自病原菌的bEVs通过TLR4-TIRF轴抑制流感复制，而共生菌bEVs通过静脉注射给小鼠，通过系统性STING诱导的I型干扰素（IFN）抑制循环中的HSV-1和VSV复制。此外，在体外，革兰氏阳性菌约氏乳杆菌的bEVs对MNV感染的抑制是通过TLR3诱导OAS通路发生的。基于不同囊泡类型诱导的多种免疫反应，我们着手确定来自肠道微生物群两个革兰氏阴性成分的bEVs如何影响MNV复制。根据我们先前的发现，共生菌阴沟肠杆菌和多形拟杆菌的bEVs含有DNA并诱导I型IFN反应，我们假设这些囊泡会通过STING等DNA介导的通路产生抗病毒免疫反应。事实上，即使在早期时间点，bEVs也增加了关键免疫标志物如ifit1、irf1、isg15和nfkb的产生。为了更全面地了解bEVs诱导的免疫调节状态，我们进行了RNA测序，并证实了DNA感知通路（以及其他通路）在bEV暴露后被激活。接下来，我们验证了STING通路中关键蛋白的表达，并使用基因敲除细胞系确认了sting在介导I型IFN产生中的重要性。我们还发现另一个DNA感知通路tlr9在抑制MNV复制中也发挥作用。总之，这些数据证实了来自共生菌E. cloacae和B. thetaiotaomicron的bEVs所包装的DNA部分负责bEV介导的MNV复制抑制。最终，这项工作为研究人诺如病毒（HNoV）发病机制提供了新的视角，并为共生菌帮助免疫活性宿主抑制肠道病毒复制提供了一条潜在通路。
Results
Pretreatment of commensal bEVs suppress MNV replication in vitro
我们先前发现，在病毒复制高峰期，体外将巨噬细胞与MNV以及来自病原菌和共生革兰氏阴性菌的bEVs共接种会导致病毒滴度下降。为了进一步探索革兰氏阴性菌bEVs的抑制作用，我们评估了来自阴沟肠杆菌和多形拟杆菌的囊泡的剂量效应。选择这两种细菌是因为它们代表了肠道微生物群的主要（B. thetaiotaomicron）和次要（E. cloacae）成分，分别定植于肠道不同区域（结肠和小肠）。此外，先前的工作表明，E. cloacae在体外促进人诺如病毒感染B细胞。用这些bEVs的系列稀释液处理RAW 264.7巨噬细胞，并在感染后18小时（hpi）测量MNV复制。两种细菌的bEVs都能以剂量依赖的方式减少MNV复制（见Figure 1A）。考虑到bEVs对病毒复制的影响先前已与免疫反应的变化相关联，我们测试了在MNV感染前用E. cloacae和B. thetaiotaomicronbEVs预处理细胞会诱导抗病毒免疫反应从而进一步抑制MNV复制的假设。有趣的是，与bEV共接种相比，所有预处理条件都未能改善MNV抑制（见Figure 1B）。对此观察结果的一个可能解释是bEVs迅速进入细胞并在内化后立即启动抗病毒反应。事实上，先前的研究表明，革兰氏阳性菌bEVs在短短15分钟内即可进入β胰岛细胞，而B. thetaiotaomicron的bEVs可在2小时内进入上皮细胞。我们先前已证明E. cloacaebEVs在孵育至少60分钟后进入RAW 264.7巨噬细胞，但未检查早期时间点。因此，我们量化了DiO标记的E. cloacaebEVs在更早时间点进入RAW 264.7巨噬细胞的情况。结果显示，囊泡摄取最早在接种后15分钟即可观察到（见Figure 1C，图S1），这支持了bEVs对细胞免疫反应具有非常快速且远超病毒复制前的影响的假设。此外，在冰上孵育的任何时间点都检测到很少或没有荧光，表明bEVs进入巨噬细胞是以能量依赖的方式进行的（见Figure 1C）。
为了评估bEVs对MNV感染的早期和持续影响，我们接下来量化了随时间变化的病毒复制。这些测定显示，E. cloacae和B. thetaiotaomicron的bEVs最早在感染后9小时就开始抑制病毒复制（见Figure 1D）。有趣的是，虽然经bEV处理的样品中病毒滴度有所增加，但在整个实验期间，它们仍然显著低于未经处理的感染培养物。由于病毒留在培养物中，且bEVs对细胞活力没有负面影响（图S2A），bEVs对宿主免疫反应的影响可能会减弱，从而允许病毒复制的再次激增。然而，我们的结果显示bEVs持续抑制MNV复制直至48小时时间点（见Figure 1D）。总之，这些数据表明bEVs对免疫信号传导具有早期且持久的影响，导致MNV复制的持续减少。
Changes in gene expression after E. cloacaebEV inoculation in RAW 264.7 macrophages
为了了解哪些免疫反应被bEVs激活以对抗MNV复制，我们利用时间进程实验样本测量了干扰素刺激基因（ISGs）的表达。我们首先量化了暴露于E. cloacaebEVs后ifit1、isg15、irf1和nfkb的表达，因为这些基因有助于抑制诺如病毒复制。RT–qPCR数据显示，虽然仅MNV组在早期时间点未能刺激显著的ISG基因产生，但E. cloacaebEV接种的样本最早在感染后3小时就显示出ISG基因表达升高（见Figure 2A）。我们接下来进行了单细胞RNA测序，以获得差异基因表达的更完整视图，并确定是否能识别出摄取了E. cloacaebEVs的单个细胞。测序了两个cDNA文库：一个有1K细胞，另一个有5K细胞。两个文库都进行了组装，由于测序深度更大提高了灵敏度，使用1K文库进行下游分析。在感染后6小时，UMAP分析识别出五个不同的亚组（图S3A），并显示模拟处理和MNV处理的细胞与bEV处理组分开聚类（见Figure 2B）。鉴于MNV复制受到抑制，很可能诱导了炎症信号，这可能导致巨噬细胞亚型的变化。使用当前的UMAP分析，标记了M1和M2群体。M1（促炎）和M2（抗炎）表示不同的巨噬细胞活化状态。比较有和没有bEVs的聚类，bEV暴露的细胞以M1群体为主，而M2细胞类型的数量在bEV暴露和未暴露组之间相似（见Figure 2C）。这一发现得到了数据统计分析的进一步支持，该分析表明bEV暴露和未暴露群体之间存在M1群体的显著差异（图S3B）。不足为奇的是，与模拟暴露细胞相比，MNV暴露细胞中的M1巨噬细胞数量也存在差异，尽管bEV暴露细胞中的M1群体仍然显著更大（图S3B）。最终，我们的scRNA-seq数据表明，bEVs的刺激导致RAW巨噬细胞向促炎M1表型发生转录偏移。
由于bEVs可以包装DNA和RNA，并且我们先前已证明E. cloacae基因组DNA与其bEVs相关，我们试图通过scRNA-seq识别摄取了bEVs的细胞。将1K cDNA文库针对E. cloacae基因组筛选是否存在细菌RNA，但在任何样本中均未检测到细菌序列，可能是由于bEVs携带的细菌RNA丰度较低。有鉴于此，将数据作为批量RNA测序数据分析，我们使用模型小鼠基因组GRCm38（mm10）来识别样本中所有差异表达基因。正如预期，从前50个变异最大的基因列表中识别出多个ISGs（例如rsad2、ifit1、mx1、cxcl10、mir155hg等）。
与UMAP分析类似，模拟处理和MNV处理组具有相似的表达模式，而仅bEV和bEV+MNV组也呈现出高度相似性（见Figure 2D）。我们比较了模拟组和仅bEV组之间的DEGs，发现在仅bEV群体中有454个上调的DEGs。DAVID功能分析普遍用于从差异表达基因中有效识别生物学相关通路。因此，使用DAVID来预测KEGG数据库注释的最主要介导通路。胞质DNA感知通路是识别出的前五个通路之一（见Figure 2E），表明E. cloacaebEV相关DNA可能在巨噬细胞的早期免疫激活中发挥作用，并可能参与bEV介导的MNV复制抑制。此外，通过对下调的DEGs进行富集分析，“bEV vs mock”和“bEV+MNV vs MNV only”都表明bEV处理对与细胞增殖减少相关的通路有负面影响（图S4）。这与我们的MTS测定数据（图S2A）以及先前发表的实验一致，该实验显示bEVs提高了细胞活力并减少了MNV感染时的细胞毒性。
许多细菌种类的bEV货物组成和含量已被分析，并且DNA含量已被证明包装在许多革兰氏阴性菌的囊泡内。由于胞质DNA感知通路在bEV处理的细胞中差异表达，我们量化了与E. cloacae和B. thetaiotaomicronbEVs相关的DNA量。测量了bEVs的总、内部和外部DNA含量，结果显示dsDNA存在于E. cloacae和B. thetaiotaomicronbEVs的外部及内部，且在囊泡内部检测到的dsDNA浓度更高（见Figure 2F）。这些数据进一步支持了RNA-seq数据，表明胞质DNA感知通路被bEVs激活。由于STING通路在感知DNA和启动抗病毒反应中起着至关重要的作用，我们首先测量了bEV+MNV处理后RAW细胞上sting-1基因的表达，发现该处理在早期感染时间点诱导了sting-1表达（图S5A）。虽然包装的dsDNA可能诱导STING信号传导，但外部结合DNA的存在表明其他DNA介导的免疫反应也可能被这些bEVs刺激。具体来说，如果bEVs通过内吞作用进入，外部结合的DNA可能会刺激内体TLR9。对tlr9的分析也显示在暴露于bEV+MNV后早期时间点基因表达上调（图S5A），表明这种DNA感知通路可能也参与MNV抑制。
Changes in protein expression after E. cloacaebEV inoculation in RAW 264.7 macrophages
我们接下来评估了DNA介导免疫通路中关键蛋白的表达。STING信号通路可以识别宿主来源或微生物的dsDNA，从而激活下游抗病毒的I型IFN产生。尽管III型IFN也作为STING激活的下游标志物，并且先前已被报道调节上皮细胞的MNV感染，但在我们的RAW 264.7巨噬细胞细胞中未表达ifnl2、ifnl3，也未由bEVs诱导，因此未包含在我们的下游分析中（图S5B）。Western blot分析显示，bEV暴露从感染后2小时开始增加磷酸化STING的表达（见Figure 3A）。磷酸化后，STING从内质网易位到高尔基体，并招募TBK1进行磷酸化。我们还在感染后2和3小时观察到P-TBK1增加（见Figure 3B）。通路中的下一步是P-TBK1催化IRF3磷酸化，这也在bEV处理后观察到（见Figure 3C）。所有三种磷酸化蛋白（STING、TBK1和IRF3）的存在证实了bEV激活了STING通路。有趣的是，在所检查的时间点，只有bEV+MNV条件诱导了明显的STING磷酸化，而仅用bEVs处理的样品显示蛋白表达增加不显著（见Figure 3A）。对于bEV处理样品可见的P-STING表达比预期弱，因此进行了免疫荧光测定以确认bEV处理后P-STING的存在。类似于阳性对照（Diabzi）的红色斑点状外观证实了STING通路的活性成分在bEV暴露后表达（见Figure 3D）。
DNA-mediated pathways aid in mediating antiviral responses upon E. cloacaebEV exposure
为了验证bEV对STING的诱导以及该通路在抑制MNV复制中的作用，我们使用了带有ISG54荧光素酶标签的sting-/-RAW细胞系。如上所述，bEV处理提高了感染和未感染的WT细胞的活力。我们还检查了它们对sting-/-细胞的影响，尽管bEV处理在一定程度上提高了细胞活力，但活力增加的程度不如在WT细胞中观察到的那么显著（图S2B）。在评估bEVs对免疫信号传导的影响时，RAW sting-/-细胞在bEV暴露后产生的ISG54显著少于WT细胞（见Figure 4A）。然而，在sting-/-细胞中仍然可以检测到ISG54，这表明除了STING之外的其他抗病毒通路也参与了bEV对ISG54的诱导。由于这些细胞在bEV处理后活力得以维持，通过测量IFNβ产生来检查了I型IFN的产生，这在抑制MNV复制中起着至关重要的作用。在感染后3和6小时，bEV处理导致了大量的IFNβ产生，而这些早期时间点在模拟和MNV条件下都不存在（见Figure 4B）。相比之下，用RAW sting-/-细胞进行bEV处理导致IFNβ产量显著降低，表明STING通路的缺失阻碍了bEVs抑制这种关键IFN激活蛋白的能力（见Figure 4B）。我们接下来量化了sting-/-细胞中的MNV复制，以确认该通路参与了观察到的bEV对复制的抑制。在感染后18小时，STING通路的缺失导致MNV感染部分恢复（见Figure 4C），这表明，虽然STING参与了bEV对MNV的抑制，但囊泡也诱导了其他免疫通路来抑制感染，正如ISG54抑制数据所示（见Figure 4A）。
鉴于其他免疫通路可能做出贡献，并且STING不是唯一由DNA刺激产生I型IFN的通路，我们转向了另一个DNA启动的抗病毒通路。卡他莫拉菌来源的EVs可以通过TLR9内体受体启动B细胞活化。我们发现，与sting表达类似，tlr9表达也在bEV处理后早期上调（图S5A）。因此，为了确定我们的bEVs是否可以通过激活TLR9来抑制MNV感染，我们使用iBMDM WT和iBMDM tlr9-/-细胞进行了bEV-MNV共感染测定。与在sting-/-巨噬细胞中观察到的类似，用Tlr9-/-细胞进行bEV处理显示IFNβ产量显著降低（见Figure 4D），并且MNV抑制部分恢复（见Figure 4E），表明STING和TLR9通路都参与了bEV对MNV的抑制。这些数据还揭示，STING通路可能是bEVs抗病毒作用的主要介导者，TLR9作用较小，并表明其他目前尚未识别的通路也参与了MNV复制的抑制。
Discussion
共生菌与肠道病毒感染有着复杂的关系。在某些情况下，这些细菌通过增强病毒粒子稳定性或通过LPS诱导免疫耐受来促进病毒感染。在其他情况下，它们通过胆汁酸启动的III型IFN来抑制病毒复制，但以区域特异性和有时细胞特异性的方式进行。最近，对细菌EVs在病毒感染期间塑造宿主免疫状态的能力进行了探索。来自病原菌的bEVs可以通过TLR4-TIRF轴在体外和离体阻断流感病毒感染，而共生菌的bEVs可以通过cGAS-STING诱导系统性免疫反应以抑制血液中的病毒复制。迄今为止，尚未报道参与bEV调节肠道病毒感染的免疫机制。为了解决这一知识空白，我们研究了共生菌bEVs在MNV感染期间对RAW巨噬细胞的影响，因为这是病毒体内和体外感染的主要且最丰富的细胞类型。
我们的研究显示，来自E. cloacae和B. thetaiotaomicron物种的bEVs在与巨噬细胞共接种时，以剂量依赖的方式减少了MNV复制。有趣的是，与共接种相比，用bEVs预处理巨噬细胞并没有进一步增强对病毒复制的抑制，这表明bEVs在细胞摄取后迅速启动了抗病毒免疫反应。支持这一点的是，标记的bEVs在15分钟内进入巨噬细胞，并且在感染后3至9小时观察到早期抗病毒效应，尽管病毒持续存在，但对MNV复制的强烈且持久的抑制持续了长达48小时。虽然当前的研究集中于巨噬细胞感染，因为它是急性MNV感染的主要细胞靶点，但未来的实验将使用其他诺如病毒毒株和细胞靶点（如树突状细胞、B细胞、T细胞和上皮细胞）探索bEVs在调节急性和持续性MNV感染中的作用。
着眼于ISGs和胞质DNA感知通路，我们接下来评估了E. cloacaebEVs激活的免疫反应。RT–qPCR显示，bEV处理的细胞表现出关键ISGs的早期诱导，而仅MNV感染的细胞在这些相同的早期时间点未能引发强烈的免疫反应。缺乏MNV诱导ISGs是预期的，因为通常直到感染后6-9小时才检测到病毒复制，并且先前已有报道在感染后4小时首次出现ISG的迹象。因此，为了在MNV免疫刺激之前捕捉bEVs进行的免疫调节的完整视图，我们使用感染后6小时的时间点进行了scRNA-seq。正如预期，模拟和仅MNV样品出现不同的聚类，另一个聚类包含仅bEV和bEV+MNV处理的样品，进一步证实bEV处理在早期时间点显著改变了除MNV复制之外的细胞基因表达。功能通路分析将胞质DNA感知通路确定为E. cloacaebEV诱导免疫激活的关键介导者，支持了bEV相关DNA有助于抗病毒防御的假设。E. cloacae和B. thetaiotaomicronbEVs外部和内部DNA的存在进一步支持了这一假设，并且还表明TLR9或其他DNA介导的免疫通路也被这些bEVs激活。观察到了P-STING、P-TBK1和P-IRF3的诱导，并确认了我们的共生菌bEVs激活了STING通路。值得注意的是，与单独bEV处理相比，bEV+MNV条件下的P-STING表达更为明显，这表明这些bEVs与病毒感染在增强该通路的免疫激活方面具有协同效应，即使在病毒未诱导基因表达的情况下也是如此。免疫荧光进一步验证了这些发现，显示在bEV暴露后存在清晰的P-STING定位，尽管在Western印迹中观察到的信号相对较弱。总体而言，这些结果表明E. cloacae和B. thetaiotaomicronbEVs通过STING磷酸化迅速激活先天免疫反应。在bEVs中检测到内部和外部DNA表明这些囊泡具有刺激多种DNA感知通路的能力。鉴于这些囊泡通过能量依赖的方式（如内吞作用）进入，这为囊泡刺激内体TLR9受体提供了机会。此外，一旦从内体释放，囊泡内容物释放到细胞质中允许刺激STING通路。因此，研究了这些通路中每一个在bEV抑制MNV感染中的作用。
为了进一步研究STING和TLR9通路在bEV介导的MNV复制抑制中的作用，利用了基因敲除细胞系和siRNA干扰。STING缺陷型RAW细胞表现出减少但仍可检测的ISG54表达以及替代抗病毒通路的激活。IFNβ产量在sting-/-和tlr9-/-巨噬细胞中显著降低，并且两种敲除细胞系都显示MNV复制部分恢复，表明两种通路都有助于bEV诱导的抗病毒免疫。这些发现共同表明E. cloacae和B. thetaiotaomicronbEVs涉及多种免疫通路，以及其他尚未识别的机制也有助于它们的抗病毒作用，并突出了bEV驱动免疫激活的复杂性。
总之，这项工作强调了共生菌bEVs通过触发早期抗病毒免疫反应来快速且持续地抑制MNV复制的潜力。我们先前发表的工作表明，来自肠沙门氏菌和约氏乳杆菌的bEVs也能抑制MNV复制，表明病原菌和共生菌bEVs在控制急性感染中具有广泛的作用。有趣的是，L. johnsonii的bEVs不是通过STING而是通过TLR3-OAS轴抑制MNV复制，这表明共生菌bEVs采用多管齐下的免疫学方法向宿主发出病毒感染信号。此外，与L. johnsoniibEVs类似，我们的数据表明E. cloacaebEVs摄取迅速并导致立即的免疫学影响，这解释了预处理没有增强抑制的原因。总体而言，共生菌bEVs代表了调节宿主抗病毒防御和控制病毒感染的一个有前途的途径。事实上，bEVs已经在作为细菌和病毒感染的潜在疫苗候选物进行测试。因此，了解这些囊泡中包含的特定成分以及它们刺激的免疫通路对于这项新技术的开发和实施至关重要。
