《Gut Microbes Reports》：An artificial mucus-integrated in vitro model enables stable live probiotic–host co-culture and recapitulates dynamic hBD-2-mediated antimicrobial feedback
编辑推荐：
本研究开发并验证了一种整合人工黏液层的新型体外肠道模型。该模型成功克服了传统共培养系统因缺乏保护性屏障而难以支持活菌与宿主细胞长期稳定共存的挑战，首次实现了活菌L. plantarum OLL2712与Caco-2细胞长达48小时的高密度（最高1:1000暴露比）共培养。研究核心发现：人工黏液层不仅是物理屏障，对维持上皮细胞活力、支持细菌增殖至关重要，更是实现功能性宿主免疫应答（如hBD-2（人β-防御素-2）蛋白分泌）的关键。该模型成功再现了“微生物刺激→抗菌肽分泌→细菌生长抑制”的完整宿主-微生物动态反馈循环，为炎症性肠病（IBD）等黏液相关肠道疾病的机制研究和益生菌筛选提供了一个可扩展、生理相关且无动物的创新平台。
引言与研究背景
人体胃肠道是一个高度复杂且动态的微生物生态系统，在营养吸收、免疫调节和维持黏膜稳态中发挥核心作用。小肠黏膜层作为宿主与腔内微生物直接接触的关键界面，其结构完整性对于选择性通透和免疫平衡至关重要。然而，现有体外模型因缺乏生理相关的黏液屏障、多依赖非活性细菌成分以及共培养时间短等问题，在模拟宿主-微生物动态互作方面存在明显局限。这限制了我们对肠道黏膜防御（如抗菌肽分泌）与微生物调控之间实时动态反馈机制的理解。因此，开发一种集成了功能性黏液屏障、可支持活菌与宿主细胞长期共培养的体外模型，具有迫切的科学需求和应用价值。
人工黏液层的构建与验证
为构建生理相关的人工黏液屏障，研究团队基于Boegh等人的配方进行了优化调整，制备了由5% (w/v) 猪胃黏蛋白、0.9% (w/v) 聚丙烯酸 (PAA) 和3.1% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 组成的混合物，pH调整至7.4。该人工黏液在Transwell小室中能形成与上层培养基清晰分离的稳定下层相，结构可在48小时内保持完整，证明了其作为物理屏障的可行性。
通过共聚焦显微镜评估其屏障能力，结果显示，在无黏液的情况下，高浓度的活菌L. plantarum OLL2712可直接接触上皮细胞。而当施加不同厚度（T1: 33 μL， T2: 66 μL， T3: 99 μL）的人工黏液层后，细菌穿透现象被显著抑制，T2和T3厚度下细菌信号被有效阻挡在上皮层约30 μm之外。这证实了人工黏液能够有效模拟天然黏液层的物理屏障功能，保护上皮细胞免受细菌直接侵袭。
人工黏液的生物相容性
研究进一步评估了不同厚度人工黏液对Caco-2单层细胞的生物相容性。经过48小时培养，各组细胞的葡萄糖消耗保持稳定，表明黏液层未对细胞基础代谢产生负面影响。同时，乳酸产量随黏液层增厚而显著增加，这可能反映了黏液扩散限制特性导致的缺氧微环境，与肠道腔内的生理状态一致。
采用4 kDa FITC-葡聚糖通透性实验评估上皮屏障完整性，结果显示所有黏液处理组的通透性与仅有细胞的对照组相当，表明黏液层未损害紧密连接功能。乳酸脱氢酶 (LDH) 释放实验也证实，不同厚度的黏液层均未引起明显的细胞毒性。这些结果表明，该人工黏液层具有良好的生物相容性，能够在长期培养中维持上皮代谢活性和屏障完整性。
人工黏液支持益生菌代谢与增殖
研究评估了人工黏液环境对益生菌L. plantarum OLL2712活性及增殖的支持能力。在含有黏液的条件下培养48小时后，细菌的葡萄糖消耗和乳酸产量均显著高于无黏液对照组，表明其代谢活性增强。
更为关键的是，菌落形成单位 (CFU) 计数显示，仅在含有黏液的条件下，活菌数量出现了约100倍的显著增长；而无黏液条件下，菌量基本维持初始水平。这表明人工黏液层为细菌的定植与增殖创造了适宜的微环境，其作用机制可能包括：作为水凝胶基质减缓营养物质扩散、提供细菌粘附和聚集的物理支架、以及缓冲氧化应激和pH变化等。这一特性对于模拟体内微生物的动态行为至关重要。
再现宿主-微生物动态互作：以hBD-2反馈环路为例
为评估该模型再现功能性宿主-微生物互作的能力，研究以人β-防御素-2 (hBD-2) 作为宿主上皮细胞对益生菌刺激的关键应答标志物。Caco-2细胞与不同初始密度（106–108CFU/mL）的L. plantarum OLL2712共培养48小时，比较有无黏液层的差异。
研究首先观察到，有黏液层时细菌大量增殖，最终可达约109CFU/mL，而上皮细胞暴露于动态增加的菌量中；无黏液层时，细菌数量基本不变，上皮细胞暴露于恒定的菌量。
实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR) 结果显示，在所有条件下，hBD-2基因表达均呈剂量依赖性上调。但有黏液层时，即使是较低细菌剂量也能诱导显著的基因表达上调；而无黏液层时，仅最高剂量（108CFU/mL）能引起明显反应。
然而，酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测hBD-2蛋白分泌的结果揭示了决定性差异：hBD-2蛋白分泌仅在含有黏液层的共培养组中被检测到（在24孔板Transwell中，106CFU/mL组为84.2 ± 37.1 pg/mL，107CFU/mL组为111.1 ± 16.0 pg/mL），其水平在相同上皮表面积和可比暴露比例下，比先前文献报道高出约100倍。相反，在无黏液层条件下，即使高剂量细菌刺激上调了基因表达，也未检测到hBD-2蛋白分泌。
LDH细胞毒性分析为此提供了关键解释：无黏液层时，暴露于108CFU/mL细菌的上皮细胞细胞毒性高达约80%，严重损害了其蛋白质翻译和分泌能力；而有黏液层时，细胞毒性维持在较低水平（≤20%），从而保障了从基因表达到蛋白分泌这一完整免疫应答通路的顺利执行。这突显了黏液层在空间屏蔽和保护上皮细胞功能方面的双重作用。
此外，终点CFU计数显示，与无细胞的黏液对照组相比，含有上皮细胞的黏液共培养系统中的细菌数量显著减少。这暗示了一个负反馈环路的形成：细菌增殖刺激上皮细胞分泌hBD-2等抗菌因子，而这些因子反过来又限制了细菌的过度生长。
结论与展望
本研究成功构建了一个整合了结构稳定人工黏液层的新型体外肠道模型。该模型首次实现了活益生菌与人类肠道上皮细胞长达48小时的稳定共培养，克服了传统系统的局限。其核心价值在于，它不仅支持细菌增殖并维持上皮活力与屏障功能，更成功再现了一个包含“微生物刺激→上皮细胞分泌抗菌肽（hBD-2）→抑制细菌过度生长”的完整、动态的宿主-微生物互作反馈循环。这一发现深刻揭示了黏液屏障在调节上皮免疫功能中的关键作用。
该模型兼具可扩展性、模块化、无动物源性及高生理相关性等优点，为深入研究宿主-微生物互作机制、高效筛选益生菌、以及建立炎症性肠病 (IBD) 等以黏液层破坏和菌群失调为特征的肠道疾病模型，提供了一个强大而实用的研究平台。
