《Inhalation Toxicology》：Application of a human bronchoepithelial—air–liquid interface model to assess respiratory hazard of VOCs using a benchmark concentration modeling approach
编辑推荐：
本文应用16HBE细胞建立气-液界面（ALI）模型，评估两种常见挥发性有机物（VOCs）——丙烯醛与甲酸的呼吸毒性。研究发现，急性暴露可导致细胞毒性、屏障功能受损，并诱导促炎（IL-8, TNFα）与氧化应激（HMOX-1）相关基因表达。通过基准浓度（BMC）建模，验证了丙烯醛现有职业暴露限值（PEL）的严格性，并揭示甲酸可能导致亚阈值的细胞损伤，为VOCs的安全评估提供了高效、可靠的新方法。
摘要
本研究旨在评估挥发性有机物（VOCs）对呼吸道上皮的影响。研究人员采用了一种in vitro（体外）人支气管上皮气-液界面（ALI）模型，以模拟更接近体内的吸入暴露环境。实验选择了两种代表性的VOCs——丙烯醛和甲酸，对16HBE细胞系进行了急性暴露（2小时），随后分析其细胞毒性、屏障功能以及相关基因表达的变化。
引言
挥发性有机物（VOCs）在室内外环境中普遍存在，与多种健康效应，尤其是呼吸道不良影响相关。传统的动物模型存在通量低、成本高、种间差异等问题，而传统的浸没式细胞培养模型则难以精确控制高挥发性毒物的剂量。因此，需要能够准确模拟人类暴露和生物反应的高通量筛选方法。气-液界面（ALI）培养的人支气管上皮细胞（如16HBE细胞）能形成紧密连接，保持关键的上皮表型，为研究吸入物质的早期效应提供了更理想的平台。丙烯醛和甲酸是环境中（尤其是灾害事件后）常见且浓度升高的VOCs，其中甲酸的呼吸毒性研究相对匮乏。
材料与方法
研究人员使用16HBE细胞系，将其培养在胶原包被的Transwell?小室上，并在第4天建立ALI。于第5天，细胞在CelTOX暴露系统中暴露于一系列浓度的丙烯醛（30, 300, 1000, 3000 ppb）或甲酸（1000, 2500, 5000, 10000 ppb），以及匹配的过滤空气对照，持续2小时。暴露后，细胞在培养箱中恢复24小时，随后收集细胞裂解物和培养基进行分析。
主要分析指标包括：
- 1.
细胞毒性：通过乳酸脱氢酶（LDH）活性检测。
- 2.
屏障通透性：使用10 kDa FITC-葡聚糖透过实验评估。
- 3.
基因表达：通过RT-qPCR检测促炎细胞因子（IL-6, IL-8, TNFα）、抗氧化基因（HMOX-1）以及线粒体自噬标志物（PINK1）的mRNA水平。
- 4.
基准浓度（BMC）建模：使用美国环保署（EPA）的BMD软件，对显示出显著效应的终点数据进行建模，计算基准浓度下限（BMCL）。
结果
细胞毒性与屏障通透性
对于两种VOCs，仅在最高测试剂量（丙烯醛3000 ppb，甲酸10000 ppb）下观察到基于LDH释放的显著细胞毒性。然而，屏障通透性在更低的剂量下就出现了剂量依赖性的增加。暴露于1000 ppb丙烯醛、2500 ppb和5000 ppb甲酸的细胞，在未出现细胞毒性的情况下，屏障通透性已显著增加。
基因表达
丙烯醛和甲酸暴露均诱导了促炎信号和氧化应激相关基因的表达。
- •
丙烯醛：在1000和3000 ppb剂量下上调了IL-8和IL-6的表达；有趣的是，仅在最低剂量（30 ppb）下上调了TNFα的表达。抗氧化基因HMOX-1的表达呈剂量依赖性增加。PINK1表达未受影响。
- •
甲酸：在5000和10000 ppb剂量下上调了IL-8的表达，在10000 ppb剂量下上调了TNFα和HMOX-1的表达。一个独特的发现是，甲酸（而非丙烯醛）在5000 ppb剂量下诱导了线粒体自噬标志物PINK1的表达。
基准剂量（BMC）建模
对具有显著效应的终点进行BMC建模后，得到了两种VOCs的BMCL值。
- •
丙烯醛：通过所有模型拟合优度检验的终点（细胞毒性和屏障通透性）得出的BMCL在199.352 ppb至234.82 ppb之间。大部分BMCL与现行监管指南（如OSHA的8小时允许暴露限值PEL）相当或更高，验证了现有标准的严格性。
- •
甲酸：所有终点的BMCL（范围从441.504 ppb到3268 ppb）均低于现行的各项监管阈值，提示支气管上皮细胞对甲酸可能特别敏感，现行标准或不足以预防其潜在的呼吸毒性。
讨论
本研究证实，ALI培养的16HBE细胞模型能够有效检测VOCs（丙烯醛和甲酸）引起的细胞毒性、屏障功能破坏以及促炎和氧化应激反应。对于丙烯醛，模型得出的BMCL支持了现有职业暴露限值的保护性。对于甲酸，研究结果则敲响了警钟：在低于所有现行监管限值的浓度下，即可观察到显著的细胞层面影响（如屏障破坏、PINK1基因上调提示的线粒体功能扰动），这表明当前基于甲醇中毒案例和动物感官刺激研究制定的甲酸暴露标准可能不够保守，有必要重新评估以充分保护呼吸健康。
该研究也存在一些局限性，例如高浓度VOCs的剂量是通过低浓度校准曲线外推得出的，以及分析的基因集合有限。然而，这些发现总体证明了16HBE ALI模型作为一种可靠的in vitro（体外）工具，在研究VOCs对气道的影响以及支持VOCs吸入危害评估方面的应用潜力。它能够产生可用于BMC建模的数据，为制定或验证保护性的暴露限值提供科学依据，特别是在传统数据缺乏的甲酸等VOCs评估方面。
