《Journal of Applied Animal Research》：Impacts of locally isolated Bacillus subtilis and Bacillus spizizenii on growth performance, carcass traits and intestinal architecture of Ross 308 broiler chickens
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本研究探讨了本地分离的两种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其混合菌剂通过饮水补充对罗斯308肉鸡的影响。结果发现，特定菌株能显著改善饲料转化率、提升肌肉持水能力并优化小肠绒毛结构，为开发高效、安全的区域特异性家禽益生菌产品提供了实证依据。
引言
家禽业在全球食品供应和经济中扮演着至关重要的角色。随着人口增长，对高效、廉价蛋白质来源的需求促使家禽营养研究不断深入，其中使用益生菌作为提升生产性能和健康的策略备受关注。益生菌被定义为“当摄入足够数量时，能为宿主带来健康益处的活性微生物”。芽孢杆菌(Bacillus)属是一类革兰氏阳性、产孢细菌，因其能耐受高温、低pH等恶劣环境以及制粒过程，并具有益生功能，被认为是优秀的益生菌候选者。除炭疽芽孢杆菌(B. anthracis)和蜡样芽孢杆菌(B. cereus)等有害致病菌株外，多数芽孢杆菌被公认为安全(GRAS)。益生菌主要通过产生抗菌物质和酶、防止有害细菌在肠道定植等方式改善动物生长、免疫功能、肠道完整性和营养消化率。枯草芽孢杆菌(B. subtilis)能分泌抗菌肽(如短杆菌肽)以及淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等多种酶类，还能合成维生素、蛋白质和多糖等功能性分子，从而增强动物的生长、健康和免疫反应。益生菌的施用途径包括饲料、饮水、灌胃、喷雾或垫料，其中饮水补充被认为能更均匀地分布并有效丰富肠道微生物多样性。本研究旨在评估通过饮水补充本地分离的枯草芽孢杆菌DK1-SA11和Bacillus spizizenii B-3541（单独及混合使用）对罗斯308肉鸡生长性能、肉品质、肠道结构和血清生化指标的影响。
材料与方法
菌株与菌悬液制备
实验所用的枯草芽孢杆菌亚种spizizenii DK1-SA11和Bacillus spizizenii B-3541菌株源自约旦科技大学兽医基础科学系。将冻存菌株划线培养后，制备浓度为1×108CFU/ml的菌悬液。混合处理组(T3)将两菌株按1:1比例混合，保持总浓度不变。
实验设计
实验于2023年2月5日至3月19日在约旦科技大学农学院动物房进行。选用200只1日龄罗斯308肉鸡，随机分为4组（T0对照组，T1、T2、T3处理组），每组初始50只。为确保均一性，在48小时内剔除弱雏后，每组保留48只，并进一步分为4个重复栏，每栏12只。采用三阶段饲养程序，光照方案为23小时光照:1小时黑暗(23L:1D)。
实验处理
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T0（对照组）：标准日粮，饮用自来水，不添加益生菌。
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T1组：标准日粮，通过饮水补充枯草芽孢杆菌DK1-SA11 (1×108CFU/ml)。
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T2组：标准日粮，通过饮水补充Bacillus spizizenii B-3541 (1×108CFU/ml)。
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T3组：标准日粮，通过饮水补充上述两种菌的1:1混合物，总浓度保持1×108CFU/ml。
益生菌处理持续整个42天的实验期。
生长性能参数
每周记录体重(BW)和采食量，每日监测健康状况和死亡率。计算平均日增重(ADG)、饲料转化率(FCR)和平均日采食量(ADFI)。
屠宰程序与胴体性状测量
所有鸡在42日龄时屠宰。屠宰前禁食4小时，从每个重复中选择体重接近平均值的2只鸡进行处理。测量宰后胴体的pH值和温度，并将胸肉样本冷冻保存以备分析。
肉品质测量
评估了40个胸肉样本（每组10个）的肉品质特性。测量指标包括蒸煮损失、Warner-Bratzler剪切力、pH值、色度坐标(L, a, b*)和持水力(WHC)。
胸肉常规成分分析
对胸肉样本进行常规化学成分分析，包括干物质(DM)、灰分、粗蛋白(CP)和总脂质（乙醚提取物）含量。
小肠组织形态学测量
在42日龄时，从每组选取10只鸡收集空肠样本进行组织学分析。测量绒毛长度(VL)、绒毛宽度和隐窝深度(CD)，并计算绒毛长度与隐窝深度比(VL:CD)。
血液生化指标测量
在1、21和42日龄时，从每组屠宰6只鸡采集血样。分离血清后，测定胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL)、甘油三酯(TRI)、低密度脂蛋白(LDL)、总蛋白(Total P)和白蛋白浓度。
统计分析
所有数据使用SAS 21统计软件包进行分析。采用一般线性模型(GLM)比较处理组间的差异，当存在显著差异时，使用Tukey事后检验进行均值比较，显著性水平设定为P < 0.05。
结果
益生菌补充对肉鸡生产性能的影响
益生菌补充显著改善了生产性能。总体而言，饲料转化率(FCR)在T2组（单独补充B. spizizenii）相比对照组(T0)得到显著改善(P < 0.05)。在生长前期（第1周），T1和T2组的FCR显著优于对照组。在第4周，混合菌剂T3组表现出最高的体重增长(BWG)，并且FCR最低（最佳）。平均日采食量(ADFI)方面，对照组(T0)的总体ADFI显著高于T1和T2组。这些结果表明，益生菌，特别是B. spizizenii和混合菌剂，能有效提高饲料利用效率，并在特定生长阶段促进增重。
禁食活重、冷胴体重和屠宰率
统计分析显示，各处理组之间在禁食活重、胴体重和屠宰率方面均无显著差异(P > 0.05)。这表明益生菌补充并未显著改变这些高度遗传性的胴体性状。
胴体分割和内脏器官重量百分比
处理对肝脏百分比有显著影响(P = 0.0115)，T1和T3组的肝脏百分比显著高于对照组。肌胃百分比也存在显著差异(P = 0.0265)，T1组最高。其他测量参数，包括胴体分割、腹脂百分比以及其他内脏器官重量，在各处理组间无显著差异。
肉品质
益生菌显著改善了肉品质。在持水能力方面，T2组（单独补充B. spizizenii）的渗出汁百分比显著低于对照组和T1组(P = 0.0002)，表明其持水能力最佳。同时，T1组（单独补充B. subtilis）的蒸煮损失百分比显著低于其他所有组(P = 0.0002)，表明其嫩度得到改善。在肉色方面，亮度(L*)受处理影响显著(P = 0.0479)，T1和T2组的值高于对照组。胸肉pH值在正常范围内(5.68–5.81)，T2组pH值显著高于T1和T3组(P = 0.0338)。
胸肉化学成分百分比
益生菌饮水补充影响了胸肉的化学成分。T2组的水分百分比显著最高(P = 0.0001)。粗蛋白(CP)含量在T1组和对照组显著高于其他处理组(P = 0.0001)。肌内脂肪（乙醚提取物）含量在T2组显著最高(P = 0.0001)。干物质(DM)和灰分百分比在T3组显著更高。
肠道形态计量学测量
芽孢杆菌 spp. 对肠道结构有显著影响。在21日龄时，对照组的绒毛长度(VL)和VL:CD比值最高。然而，到了42日龄，尽管VL的处理效应仅呈现显著性趋势(P = 0.0600)，但T3组的VL数值最高。更重要的是，T3组的绒毛宽度显著低于其他所有组(P = 0.0001)，并且其在42日龄时的VL:CD比值显著最高(8.3)，这主要是由于隐窝深度(CD)的显著降低所致(P = 0.0001)。这表明混合菌剂通过减少隐窝深度，优化了肠道结构，提升了养分吸收效率。
血液生化
在血清生化参数方面，各处理组在21日龄和42日龄的胆固醇水平无显著差异。在42日龄时，T1和T2组的甘油三酯水平显著高于对照组和T3组(P = 0.0092)。高密度脂蛋白(HDL)水平在各组间无显著差异。在42日龄时，T1和T2组的低密度脂蛋白(LDL)水平显著高于对照组和T3组(P = 0.0393)。21日龄时，对照组的血清总蛋白含量显著高于T2和T3组(P = 0.0275)。各处理组间的白蛋白水平在任何日龄均无显著差异。
讨论
生产性能
本研究观察到的水溶性芽孢杆菌益生菌的优异效果，归因于芽孢杆菌孢子固有的强健性和高存活率。孢子能耐受饲料加工中的物理压力和高温，并在模拟的胃肠道(GIT)恶劣条件下存活和增殖。混合菌剂T3在关键的第四周表现出最显著的增重效果，而单菌株T2则在第1周显著改善了FCR。这种改善与所使用的本地芽孢杆菌分离株产生的特定生物活性化合物密切相关。B. spizizenii (T2)和混合菌剂(T3)已知是脂肽和羊毛硫抗生素（如枯草菌素、霉菌枯草菌素和表面活性素）的高产菌株。这些化合物的协同作用是驱动性能提升的核心机制。其作用机制主要包括：1) 病原体抑制：脂肽和羊毛硫抗生素具有广谱抗菌活性，能有效抑制产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等主要病原体，并抑制有害真菌生长及霉菌毒素生物合成，从而减少系统毒性负荷。2) 肠道健康调节：益生菌干预能调节肠道环境，增强肠道屏障。研究表明，枯草芽孢杆菌补充能显著增加紧密连接蛋白（如Occludin和ZO-1）的表达，并提高空肠黏膜中免疫球蛋白IgA和IgG的水平，同时增加丁酸盐产生菌和潜在益生菌的丰度。3) 生长与效率：通过下调促炎细胞因子和改善屏障功能，减少了系统炎症，将能量从免疫防御重新导向体细胞生长和肌肉沉积，从而提高了代谢效率。这与观察到的FCR显著改善（特别是在T2和T3组的育雏期和育肥期）以及T3组在第4周获得显著更高BWG的结果一致。然而，试验后期（第5周）整体生产性能指标（如BW和ADG）的下降和FCR结果的不一致，表明当前剂量方案存在局限性。这可能是由于饲养后期病原体负荷增加和应激加大，而口服益生菌的浓度或活力未能跟上，导致病原体反弹，宿主免疫防御消耗能量增加，从而造成FCR变差和生长减缓。这提示在生产周期最后几周可能需要脉冲式或更高剂量的益生菌来维持中期获得的有益效果。
胴体性状与屠宰率
最终加工特性分析表明，各处理组间的禁食活重、胴体重和屠宰率在统计学上相似。这一结果与许多研究一致，表明枯草芽孢杆菌补充主要作为生长促进剂，通常不会显著改变高遗传性的胴体品质性状。屠宰率缺乏变化是可以预料的，因为该比率很大程度上由鸡的遗传潜力决定，对益生菌提供的普遍代谢增强作用不太敏感。然而，现有文献存在矛盾，这凸显了益生菌干预具有菌株和剂量依赖性。一些研究报告了补充枯草芽孢杆菌后肉鸡胴体特性的改善，而另一些研究则指出需要特定的多菌株组合才能显著提升所有研究的胴体性状。本研究中多菌株配方在促进整体增重方面效果显著，但可能缺乏诱导营养物质向瘦肉和肌肉组织沉积的特定代谢物或协同作用，从而未能显著提高屠宰率。
肉品质
益生菌补充显著影响了肉品质。B. spizizenii (T2)补充显著提高了胸肉的持水能力(WHC)，表现为渗出汁百分比显著降低。同时，B. subtilis (T1)补充显著降低了蒸煮损失。这些改善并非由于总蛋白质含量的变化（本研究中粗蛋白含量无显著差异），而是可能与肌肉纤维结构完整性的改善有关。芽孢杆菌化合物可能通过抗氧化机制减少氧化应激和肌肉蛋白质损伤，从而维持蛋白质的天然构象，增强其持水能力。T2组较高的最终pH值(5.81)与其优异的持水能力相符。较低的最终pH值会影响肉色，而本研究中观察到的pH值小于6，可能解释了芽孢杆菌对胸肉亮度的影响。剪切力(SF)值在各组间无显著差异。
胸肉化学成分
饮水补充芽孢杆菌益生菌影响了胸肉的化学成分。单菌株B. spizizenii (T2)显著提高了胸组织中的水分和乙醚提取物（肌内脂肪）百分比。而两种芽孢杆菌的混合物(T3)则显著提高了干物质(DM)和灰分百分比。灰分含量的增加表明两种菌株的协同作用可能通过改善肠道健康，增强了肌肉对必需矿物质的吸收和沉积。粗蛋白(CP)含量在对照组和益生菌组之间无显著差异，表明补充对总肌肉蛋白数量没有整体影响。此外，胸肉的化学成分（灰分除外）已知受性别影响，而本研究中雏鸡未分性别，因此不能排除性别对这些发现的潜在影响。
血液生化
虽然在各处理组间，21日龄和42日龄的总胆固醇或高密度脂蛋白(HDL)水平均未发现显著差异，但到42日龄时，所有处理组的总胆固醇均有下降趋势。这种随年龄增长胆固醇降低的现象可能与鸟类成熟后脂质代谢和胆囊功能的改善有关。HDL水平在对照组和T3（多菌种）组于42日龄时显著增加。甘油三酯水平在42日龄时于T1和T2（单菌种给药）组显著升高。总体而言，通过饮水进行多菌种给药(T3)有利于更高的HDL水平，提示对心血管健康有潜在的更好结果。然而，甘油三酯和HDL的浓度均明显高于正常生理范围，这需要谨慎解释这些发现。在21日龄时，对照组的血清总蛋白水平最高，并与其他处理组有显著差异，但到42日龄时，各组间无显著差异。较年轻的鸟类通常利用膳食蛋白质进行快速生长和代谢功能；然而，到42日龄时，代谢过程倾向于转向脂肪沉积和能量储存。通过饮水施用单一或混合细菌物种可能早在21日龄时就增强了鸟类对蛋白质的利用，支持了其生物和代谢活动。本研究中益生菌补充对白蛋白水平没有显著影响。
肠道结构
肠道结构——特别是绒毛长度与隐窝深度比(VL:CD)——是养分吸收效率的重要指标。虽然对照组的绒毛始终最长，但益生菌补充组的隐窝深度(CD)显著降低(P = 0.0001)。这种减少对T3组（多菌种给药）在42日龄时的VL:CD比值产生了积极影响，使其达到所有处理中的最高平均值(8.3)，表明养分同化增强，这与观察到的性能改善一致。关键发现是，芽孢杆菌主要通过减少CD来实现这种结构改善。较浅的隐窝反映了上皮细胞更新率的降低，这被解释为维持肠道完整性的代谢能量成本减少。这一发现与以下理解一致：芽孢杆菌物种通过调节肠道环境和减少微生物挑战，节省了能量，随后将这些能量重新导向生长。这种机制与其他天然添加剂（如植物精油）的作用形成鲜明对比，后者通常通过增加绒毛长度来改善VL:CD比值，而这通常与更深的CD和更高的增殖活性相关。这种差异突显了芽孢杆菌的作用机制优先考虑肠道稳定性和代谢效率，而不是快速的细胞更新。此外，VL:CD比值的益处在42日龄时显现，而在21日龄时未显现，这表明芽孢杆菌 spp. 对肠道结构产生最佳效果至少需要三周的滞后期。
结论
本研究证明，日粮补充本地分离的枯草芽孢杆菌和Bacillus spizizenii能有效改善肉鸡的特定生产性能和肉品质性状。虽然总体体重在各组间具有可比性，但单菌株补充（特别是B. spizizenii）在育雏期和育肥期显著改善了饲料转化率(FCR)，表明了更优的代谢效率。在肉品质方面，芽孢杆菌补充通过减少蒸煮损失和渗出汁，显著提高了持水能力(WHC)，从而改善了出肉率和质地。此外，多菌种混合物（枯草芽孢杆菌和B. spizizenii）在42日龄时达到了最高的绒毛长度与隐窝深度比(VL:CD)。这种结构改善主要是由隐窝深度(CD)的显著减少驱动的，表明维持肠道所需的代谢成本更低，养分吸收得到优化。综上所述，这些发现强调了本地分离的芽孢杆菌物种作为针对性、区域特异性益生菌策略，在改善可持续家禽生产中的肠道健康和肌肉品质方面具有潜力。
