《Journal of Environmental Science and Health, Part B》：Optimization of detection of twelve polycyclic aromatic hydrocarbons in Carpathian barbel (Barbus carpathicus) tissues: extraction methods and GC-MS parameters
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本研究建立并验证了喀尔巴阡鲃（Barbus carpathicus）组织（肌肉与肝胰脏）中12种多环芳烃（PAHs）的气相色谱-质谱（GC-MS）选择性离子监测（SIM）方法。文章系统优化了色谱柱与温度程序（DB-EUPAH柱分离效果更优）、样品前处理（机械振荡提取优于超声辅助提取）及固相萃取（SPE）净化流程。该方法在25分钟内完成了关键同分异构体的有效分离，经方法学验证，具有优异的线性（R2≥ 0.995）、精密度（RSD ≤ 10%）及较低的检出限与定量限，为鱼类PAHs污染监测与食品安全风险评估提供了可靠的分析工具。
引言
多环芳烃（PAHs）是一类因其水溶性低、亲脂性高而在环境中持久存在并易于生物蓄积的有机污染物，主要来源于有机物质的不完全燃烧。许多PAHs具有诱变和致癌特性，其中研究最广泛的苯并[a]芘（benzo[a]pyrene）可对胎儿发育、癌症风险等构成潜在威胁。淡水鱼是人类获取优质蛋白质、Omega-3脂肪酸和微量营养素的重要来源，但也可能因PAHs的累积而带来健康风险。欧盟法规（如EC 1881/2006及其后续修订）对食品中PAHs的最大限量进行了规定，评估方式已从单一的苯并[a]芘转向对PAH4（苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、?）或PAH8等一组优先PAHs的总和进行综合评价。因此，优化淡水鱼PAHs的分析方法，对于支持环境监测、评估食用鱼组织中的污染物浓度、从而保护鱼类种群和人类健康至关重要。常用的检测技术包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。本研究旨在利用12组分PAHs混合标准溶液，优化色谱-质谱参数，并开发适用于喀尔巴阡鲃可食部分的样品前处理程序，以期建立可同时测定多种重要PAHs的分析方法。
材料与方法
实验使用了包括环己烷、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯在内的有机溶剂。标准溶液为包含16种PAHs的认证混合标准品。样品前处理核心包括：从斯洛伐克斯兰纳河段采集的喀尔巴阡鲃的轴肌和肝胰脏组织，经冷冻干燥处理后，精确称取冻干样品，分别采用甲苯溶剂进行超声辅助提取和机械振荡器辅助提取，随后经过匀浆、离心、过滤、氮吹浓缩、复溶等步骤。浓缩液再通过固相萃取（SPE）小柱（Chromabond?CN/SiOH）进行净化，比较了二氯甲烷和乙酸乙酯作为洗脱溶剂的净化效果，最终选用二氯甲烷。净化后的洗脱液经氮吹、复溶于净化后的环己烷，供GC-MS分析。
色谱-质谱分析在Agilent 7890B气相色谱仪与5977A质谱仪联用系统上进行。本研究重点评估了两种色谱柱：通用型非极性柱HP-5ms（30 m x 0.25 μm x 0.25 mm）和对PAHs具有选择性的中极性柱DB-EUPAH（20 m x 0.14 μm x 0.18 mm）。在方法优化过程中，共测试了五种不同的温度程序。质谱检测器在优化阶段使用全扫描模式，在最终方法中则采用选择性离子监测（SIM）模式以提高灵敏度与特异性。
结果与讨论
色谱-质谱参数的设定
通过对比不同温度程序下的色谱图，DB-EUPAH柱在分离关键PAH同分异构体（特别是苯并荧蒽异构体B(b)F、B(j)F、B(k)F）方面表现出更优的性能，峰形更对称，基线在高温下更稳定。而HP-5ms柱虽然分析时间可能更短，但存在关键异构体共流出以及高沸点化合物（如茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[ghi]苝）基线显著抬升的问题。因此，研究选择了DB-EUPAH柱以及特定的温度程序：起始150°C保持1.4分钟，以10°C/分钟升至270°C保持0.5分钟，再以5°C/分钟升至310°C保持3.6分钟，总运行时间为25.5分钟。此程序能在满足欧盟法规对异构体特异性定量要求的前提下，实现PAHs的有效分离。
在SIM模式下，方法灵敏度显著提高，可实现对12种PAHs混合标准溶液（5 ng/mL）的清晰检测与分离。尽管16组分标准品中的其他4种PAHs（二苯并[a,i]芘等）因沸点过高未在25.5分钟内检出，但优化后的方法覆盖了多种重要的PAHs化合物。
样品前处理的优化
在样品提取步骤，比较了超声浴提取和机械振荡器提取。结果表明，在未进行SPE净化的条件下，振荡器提取（260 rpm，1小时）在12-16分钟保留时间窗口内获得了更高的峰面积和更好的色谱分辨率。因此，后续研究选定机械振荡器提取作为标准方法。
在SPE净化步骤，考察了不同溶剂的影响。使用经无水硫酸钠干燥的环己烷进行SPE柱活化，可最大限度地减少溶剂自身引入的杂质和基质背景干扰。在洗脱溶剂选择上，与乙酸乙酯相比，二氯甲烷能提供更洁净的色谱背景（即使未经干燥处理）。因此，最终优化的SPE净化流程采用干燥环己烷活化，二氯甲烷洗脱。
优化方法的方法学验证
方法学验证依据ISO/IEC 17025:2005标准进行。为评估线性、可靠性、检出限（LOD）和定量限（LOQ），研究制备了不同浓度范围的校准曲线。验证结果表明，在测试的12种PAHs中，有10种获得了满意的线性（R2≥ 0.995，线性偏差<20%）和精密度（相对标准偏差RSD ≤ 10%）。各验证分析物的LOD范围为0.3至2.2 ng/mL，LOQ范围为0.95至6.85 ng/mL。苯并[a]蒽在初始测试范围（5-25 ng/mL）内未呈现满意线性，但在更低的浓度范围（2-10 ng/mL）内实现了线性。茚并[1,2,3-cd]芘和二苯并[a,h]蒽由于共流出问题，即使在高达50-250 ng/mL的浓度下也未能成功验证。
通过向喀尔巴阡鲃冻干组织样品中添加多组分标准混合物（250 ng/mL）进行加标回收实验，计算了10种PAHs的回收率。整体回收率范围在63.1%至146.0%之间。其中，苯并[k]荧蒽的回收率低于可接受范围的下限（<70%），而苯并[b]荧蒽则高于上限（>120%）。其余8种PAHs（5-甲基?、7H-苯并[c]芴、苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[ghi]苝、苯并[j]荧蒽、环戊并[c,d]芘、?）的回收率落在70-120%的可接受范围内，表明该方法适用于喀尔巴阡鲃组织中这8种主要PAHs的测定。
结论
本研究成功优化了用于测定喀尔巴阡鲃冻干肌肉及肝胰脏组织中多环芳烃的气相色谱-质谱方法。在五种测试的温度程序和两种色谱柱中，DB-EUPAH柱展现出更优的分离效率和选择性。尽管总运行时间仅为25.5分钟，但可可靠地鉴定出12种PAHs，并对其中8种进行了方法学验证。验证结果显示该方法线性良好、精密度高（LOQ为0.95–6.55 ng/mL，RSD < 10%），加标回收率满足要求（70-120%）。在样品前处理方面，机械振荡器提取的效果优于超声辅助提取。尽管苯并[k]荧蒽和苯并[b]荧蒽的回收率超出了推荐范围，但所建立的方法对于监测鱼类组织中的主要PAHs是有效的。这些发现支持了该方法在常规分析中的适用性，并为未来改进以检测高分子量PAHs提供了有价值的基础。
