内源性H2S通过HSPA8硫水化下调HIF1α并预防脓毒症心肌损伤中的铁死亡

《Redox Report》：Endogenous H?S promotes HSPA8 sulfhydration to downregulate HIF1α and prevent ferroptosis in septic myocardial injury

这项研究揭示了硫化氢（H2S）通过促进分子伴侣HSPA8蛋白的第574位半胱氨酸（Cys574）发生硫水化修饰（S-sulfhydration），从而加速低氧诱导因子1α（HIF1α）的降解，并抑制其下游靶点BNIP3（Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3），最终有效减轻脓毒症诱导的心肌损伤（SIMI）中的铁死亡（ferroptosis）和炎症反应。研究还发现天然化合物大蒜素（Allicin）作为一种安全的H2S供体，能够恢复内源性H2S水平，通过上述机制发挥显著的心脏保护作用，为治疗脓毒症心肌病提供了新的潜在策略。

　　

引言

脓毒症（Sepsis）是全球范围内一个重大的临床挑战，其发病率和死亡率居高不下。在脓毒症的众多并发症中，脓毒症诱导的心肌损伤（Sepsis-induced myocardial injury, SIMI）是导致患者不良预后的关键因素，但其分子机制尚未完全阐明。硫化氢（Hydrogen sulfide, H₂S）是一种重要的内源性气体信号分子，在心血管稳态中发挥关键作用。蛋白硫水化（Protein S-sulfhydration）是H₂S调控蛋白质功能的重要翻译后修饰机制。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式，已被证实在SIMI的发病机制中扮演重要角色。本研究旨在深入探索H₂S通过蛋白硫水化修饰调控HIF1α（Hypoxia-inducible factor 1-alpha）通路从而抑制铁死亡，进而减轻SIMI的具体分子机制，并评估天然产物大蒜素（Allicin）的治疗潜力。

材料与方法

研究采用了体内和体外脓毒症模型。体内模型使用雄性C57/BL6小鼠，通过盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture, CLP）建立SIMI模型。实验还使用了心肌细胞特异性CSE敲除（CSE-cKO）小鼠。体外模型使用AC16人心肌细胞，以脂多糖（LPS）刺激模拟脓毒症环境。主要干预手段包括使用外源性H₂S供体GYY4137以及天然H₂S供体大蒜素。通过超声心动图评估心功能，采用蛋白质印迹法（Western blot）、实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、免疫荧光染色、透射电子显微镜、酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术检测相关蛋白表达、细胞死亡、炎症因子和铁死亡标志物。使用生物素转换法（Biotin-switch assay）检测蛋白硫水化水平。通过定点突变、免疫共沉淀（Co-IP）和基因沉默/过表达等技术验证HSPA8（Heat shock protein family A (Hsp70) member 8）与HIF1α的相互作用及Cys574位点的功能。

结果

1. 脓毒症抑制CSE/H₂S通路，外源性H₂S可减轻心肌损伤

在心肌细胞中，LPS刺激显著降低了胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine-γ-lyase, CSE）的蛋白和mRNA水平以及内源性H₂S含量，表明脓毒症抑制了CSE/H₂S通路。外源性H₂S供体GYY4137能剂量依赖性地恢复细胞活力，并降低LPS诱导的促炎细胞因子（IL-1β， IL-6， IL-8， TNF-α）和心肌损伤标志物（LDH， CK-MB， cTn-l）的释放。在动物模型中，CLP手术同样降低了心脏组织CSE表达和血清H₂S水平。CSE敲除加剧了CLP引起的心肌细胞凋亡（TUNEL阳性增加）、心功能不全（射血分数EF和缩短分数FS下降）及心肌组织结构破坏。而GYY4137处理能显著改善这些病理变化。

2. 铁死亡是脓毒症心肌病的关键环节，受CSE/H₂S通路调控

在多种程序性细胞死亡抑制剂中，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 (Fer-1)对LPS诱导的心肌细胞活力下降保护作用最显著。LPS刺激导致铁死亡关键蛋白GPX4（Glutathione peroxidase 4）表达下调，细胞内Fe²⁺和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）水平升高，这些标志物的变化在CSE敲低后加剧，而GYY4137处理能逆转。在体实验中，CLP小鼠心肌GPX4表达下降，Fe²⁺和MDA积聚，CSE缺失加重了这些铁死亡特征，GYY4137则起到保护作用。使用铁死亡诱导剂Erastin可以取消GYY4137的保护效应，而敲低GPX4同样废除了H₂S对心肌损伤和炎症的缓解作用，证实H₂S主要通过抑制铁死亡发挥心脏保护功能。此外，体内应用Fer-1能显著改善CLP小鼠的心功能、减轻心肌损伤和线粒体结构破坏。

3. H₂S通过抑制HIF1α信号通路减轻脓毒症心肌铁死亡

研究发现，脓毒症条件下心肌组织和细胞中HIF1α蛋白表达显著上调，而GYY4137处理能有效降低其表达。功能获得和功能缺失实验证实，敲低HIF1α可以模拟GYY4137的保护作用，恢复GPX4表达，降低Fe²⁺和MDA水平；而过表达HIF1α则废除了GYY4137对铁死亡的抑制作用。在体实验进一步表明，HIF1α敲低减轻了CLP诱导的心肌细胞死亡、心肌损伤评分升高、血清心肌酶释放以及心功能下降和线粒体损伤，而过表达HIF1α则逆转了GYY4137的这些保护效益。细胞实验也得到一致结果，HIF1α敲低能改善细胞活力，减少损伤标志物和炎症因子释放，而过表达则抵消H₂S的保护作用。

4. BNIP3作为HIF1α的下游效应分子介导铁死亡和心肌损伤

BNIP3是HIF1α的已知下游靶基因。研究发现，在CLP和LPS模型中，BNIP3的表达均显著上调，而GYY4137处理能抑制其表达。HIF1α的敲低或过表达能相应地降低或升高BNIP3的mRNA水平，证实了BNIP3受HIF1α转录调控。功能上，激活HIF1α（使用激动剂FZ）会加剧LPS引起的细胞活力下降、铁死亡标志物（Fe²⁺， MDA）累积以及心肌损伤标志物（LDH， CK-MB， cTn-l）释放，而敲低BNIP3则能显著缓解这些损伤。

5. H₂S通过促进HSPA8蛋白Cys574位点硫水化来降解HIF1α

机制探索发现，GYY4137不影响HIF1α的mRNA水平，提示其调控发生在蛋白质层面。通过筛选与HIF1α相互作用的硫水化蛋白，分子伴侣HSPA8被鉴定为关键靶点。质谱分析确认HSPA8的Cys574位点发生硫水化修饰。生物素转换实验证实，脓毒症条件下HSPA8的硫水化水平降低，而GYY4137处理可恢复其修饰。免疫共沉淀实验证明HIF1α与HSPA8存在相互作用，且这种相互作用在LPS刺激后减弱，经GYY4137处理后增强。关键的是，将HSPA8的Cys574位点突变為丝氨酸（C574S）后，H₂S无法再促进HIF1α与HSPA8的结合，也无法降低HIF1α蛋白水平、抑制其下游BNIP3的表达、恢复GPX4水平、改善细胞活力或减轻心肌损伤和炎症。这些结果证明，H₂S通过促进HSPA8在Cys574位点的硫水化，增强了其与HIF1α的相互作用，从而促进了HIF1α的降解，这是H₂S发挥心脏保护作用的核心分子机制。

6. 大蒜素（Allicin）通过恢复H₂S水平发挥心脏保护作用

研究评估了天然化合物大蒜素（Allicin）的作用。Allicin处理能有效恢复LPS刺激导致的心肌细胞内H₂S含量下降。同时，Allicin能上调GPX4蛋白表达，降低细胞内Fe²⁺和MDA水平，提高细胞活力，并减少LDH、CK-MB和cTn-l等心肌损伤标志物的释放。这些结果表明，Allicin作为一种内源性H₂S供体，能够模拟外源性H₂S供体的保护作用，通过抑制铁死亡来减轻脓毒症心肌损伤。

讨论

本研究系统阐明了H₂S在脓毒症心肌损伤中的保护作用及其全新机制：H₂S通过促进分子伴侣HSPA8在Cys574位点的硫水化修饰，增强其与转录因子HIF1α的相互作用，从而促进HIF1α的降解；HIF1α水平的下降导致其下游靶基因BNIP3的表达抑制，最终阻断了铁死亡的发生，缓解了心肌损伤和炎症反应。这一“H₂S–HSPA8–HIF1α–BNIP3–铁死亡”轴为理解SIMI的发病机制提供了新的视角。研究还首次发现天然产物大蒜素（Allicin）能有效恢复内源性H₂S水平，并通过上述机制发挥心脏保护作用，且安全性高，具有显著的转化医学潜力。本研究不仅深化了对H₂S蛋白质翻译后修饰功能的认识，也为开发靶向该通路治疗脓毒症心肌病的新策略奠定了坚实的实验基础。

研究局限性

本研究存在一些局限性。首先，GYY4137和大蒜素的体内药代动力学、最佳剂量及长期安全性有待进一步评估。其次，研究主要聚焦于HIF1α/BNIP3/铁死亡轴，脓毒症心肌功能障碍中涉及的其他信号通路和细胞类型未充分探索。第三，尽管证实了HSPA8硫水化的作用，但H₂S修饰的下游分子事件及潜在脱靶效应需进一步阐明。第四，本研究揭示了HSPA8-Cys574硫水化与HIF1α蛋白水平下降相关，但其精确的分子机制（如是否通过促进泛素化-蛋白酶体降解途径）有待未来实验验证。第五，本研究的设计与我们之前发表的关于肾脏的研究是平行验证，虽在核心指标和动物模型上保持一致，但缺乏直接的跨器官比较数据。

结论

综上所述，本研究发现CSE/H₂S通路的功能障碍通过促进HIF1α驱动的铁死亡和炎症，在SIMI的发病机制中起着关键作用。重要的是，我们鉴定出天然H₂S供体大蒜素（Allicin）是一种能有效恢复内源性H₂S水平、抑制铁死亡、并在脓毒症体内外模型中减轻心肌损伤的药物。从机制上讲，Allicin和外源性H₂S供体（如GYY4137）通过硫水化修饰HSPA8蛋白的Cys574位点发挥保护作用，从而促进HIF1α降解并抑制下游BNIP3介导的铁死亡和线粒体功能障碍。这些结果不仅拓展了我们对脓毒症心肌病氧化还原调控机制的理解，也凸显了靶向CSE/H₂S–HSPA8–HIF1α轴的转化潜力。作为一种临床可及、天然来源的化合物，Allicin为预防和治疗脓毒症诱导的心功能不全提供了有前景的治疗策略，值得在临床环境中进一步研究。