HNRNPA2B1的机制研究：它虽结合m6A修饰RNA，但并非其选择性识别蛋白

《RNA Biology》：Mechanistic studies on HNRNPA2B1 suggest binding but not selective recognition of m6A

这篇综述结合计算与实验研究，阐述了HNRNPA2B1结合m6A修饰RNA的机制。研究挑战了其作为选择性m6A读取器的传统观点，指出其高亲和力主要由AGG和UAG基序驱动，而m6A的影响取决于具体序列背景。这加深了我们对RNA结合蛋白识别修饰及在疾病（如阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症）中作用的理解。

　　

N⁶-甲基腺苷 (m⁶A) 是信使RNA中最丰富的转录后修饰之一，在多种细胞过程和疾病中发挥关键调控作用。作为异质核糖核蛋白 (HNRNP) 家族的一员，HNRNPA2B1 因其两个RNA识别基序 (RRM) 结构域而被研究作为潜在的m⁶A“读取器”蛋白。然而，其识别m⁶A的分子机制和选择性一直存在争议。早期研究表明其靶向组与m⁶A甲基化基序RGAC有所重叠，但关于其对含m⁶A转录本结合亲和力和选择性的具体细节却不甚清晰。

本研究采用了结合态分子动力学 (MD) 模拟、自由能计算以及体外结合实验（如微量热泳动，MST）来系统探究HNRNPA2B1对RNA的结合机制。研究首先以高亲和力的10聚体RNA序列 (5′-AAGGACUAGC-3′) 与HNRNPA2B1的共晶结构为基础，该序列同时包含了RRM1和RRM2结构域的首选结合基序AGG和UAG。模拟与计算结果显示，该序列的结合稳定性主要由AGG和UAG基序与各自RRM结构域之间的相互作用驱动，特别是关键的氢键和盐桥，这些相互作用在突变基序（如GGG、ACG、AGC）中会被削弱。

Computational Methods

研究团队建立了一系列HNRNPA2B1-RNA复合物的模拟模型。他们采用了原子显式溶剂分子动力学模拟，并利用VINARDO方法计算结合自由能，结果显示与之前的实验数据高度相关。为了理解具体的相互作用细节，他们还进行了残基-核苷酸对的相互作用自由能分解分析。

Results

对于核心序列5′-AAGGACUAGC-3′，模拟揭示了腺嘌呤位于第5位 (Ade5) 时的两种主要构象：大多数情况下它插在两个RRM结构域之间，少数情况下则暴露于溶剂。引人注目的是，当在相同位置引入m⁶A修饰，形成5′-AAGG-m⁶A-CUAGC-3′时，m⁶A也表现出类似的两种构象。最关键的计算发现是，含m⁶A序列与未修饰序列的结合自由能几乎相同，仅略有不佳。这意味着m⁶A本身并未显著增强或破坏整体结合。结合能的主要贡献依然来自AGG和UAG基序，而位于这两个基序之间的第五位核苷酸（无论是A还是m⁶A）对结合贡献甚微。当m⁶A置于其他位置时，情况则有所不同。当m⁶A位于AGG基序中的第二位 (5′-A-m⁶A-GGACUAGC-3′) 时，结合亲和力相比未修饰序列出现了轻微但显著的下降。然而，自由能微扰计算表明，单独的m⁶A碱基与未修饰腺嘌呤在RRM1的结合口袋中的结合自由能几乎相同，表明结合差异可能源于与邻近核苷酸相互作用的细微变化，而非修饰碱基本身的直接排斥。

为了探索HNRNPA2B1是否可能识别其他RNA修饰，研究还进行了基于筛选的计算搜索。结果显示，除了m⁶A，腺嘌呤的其他修饰如异戊烯腺苷 (i⁶A) 和N⁶，N⁶-二甲基腺苷 (m⁶₂A) 在第二位也能被较好地容纳。此外，假尿苷 (Ψ) 和5-甲基尿苷 (m⁵U) 在第七位，以及2′-O-甲基腺苷 (Am) 在第八位也显示出潜在的结合可能性，这提示HNRNPA2B1可能具有识别多种RNA修饰的潜力。

Experimental Methods

为了验证计算结果，研究者进行了体外结合实验。他们纯化了HNRNPA2B1的RRM结构域融合蛋白，并使用Cy5标记的RNA寡核苷酸通过微量热泳动技术测量了结合亲和力。实验结果有力地支持了计算预测：5′-AAGGACUAGC-3′（未修饰）与5′-AAGG-m⁶A-CUAGC-3′（m⁶A位于第五位）的结合解离常数 (K_D) 非常接近，仅有约10 nM的微小差异，后者亲和力略低。这与计算显示的“影响甚微”完全一致。同时，实验也证实了5′-A-m⁶A-GGACUAGC-3′（m⁶A位于第二位）的结合亲和力确实出现了下降，约为80 nM。

Discussion

综合所有发现，本研究提出了一个核心结论：HNRNPA2B1并非m⁶A的“选择性”读取器。相反，它对m⁶A的结合具有高度序列依赖性。当m⁶A位于AGG和UAG两个高亲和力基序之间时（如在GGACU或GG-m⁶A-CU上下文中），其对整体结合的影响微乎其微，因为结合主要由两侧的GG和U驱动。只有当m⁶A位于关键的识别基序内部（如AGG）时，才会因其可能干扰核心相互作用而导致亲和力轻微减弱。

这一机制与经典的、具有明确m⁶A识别口袋的YTH家族读取器蛋白形成了鲜明对比，凸显了HNRNPA2B1及其RRM结构域识别特性的更高复杂性。研究结果对理解HNRNPA2B1在疾病中的作用具有重要启示。HNRNPA2B1与阿尔茨海默病 (AD) 中的Tau蛋白寡聚体、肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和额颞叶痴呆 (FTLD) 等多种神经系统疾病相关，并且其过表达对神经元存活有害。论文推测，在疾病背景下，神经元内高水平的m⁶A可能通过与HNRNPA2B1的高亲和力（而非特异性）结合，促进HNRNPA2B1与Tau在应激颗粒中的共定位和共聚集。因此，HNRNPA2B1在这些病理途径中的作用，可能更多归因于其对特定序列（包括含m⁶A的序列）的高亲和力结合能力，而非作为选择性m⁶A读取器的特异性功能。

总而言之，这项工作通过多学科方法阐明了HNRNPA2B1与RNA（包括修饰RNA）结合的复杂机制，挑战了其作为经典m⁶A读取器的简单观点，并为其在生理和病理条件下的功能提供了新的分子层面的解释。