《Analytica Chimica Acta》：Preparation of styrene-maleic anhydride copolymer nanobrush chromatographic stationary phase and its application in phospholipid analysis of exosomes
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磷脂组学分析新方法：基于可控自由基聚合制备的混合相硅胶柱实现外泌体磷脂高效分离与质谱联用分析，发现9类磷脂200余种亚型及其与乳腺癌的关联标志物。
Ping Wang|Meijuan Xue|Xinhui Guan|Xiaofei Gu|Xiaoqiang Qiao
河北大学药学院，教育部药用化学与分子诊断重点实验室，保定071002，中国
摘要
背景
血清外泌体中的磷脂是乳腺癌诊断的有前景的生物标志物。然而，由于磷脂固有的结构异质性和存在异构形式，使用液相色谱法分离磷脂面临多个挑战。传统色谱柱通常难以区分不同磷脂物种的保留时间，这会导致分辨率较低和定量困难。此外，不同磷脂类别的极性和疏水性不同，需要专门的固定相才能实现最佳分离效果。本研究旨在开发一种新型色谱材料，用于复杂生物基质中磷脂的全面分析。
结果
在本研究中，首次通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合技术制备了一种新型基于硅的Sil-SMA-GMS共聚物刷状固定相，使用苯乙烯-马来酸酐（SMA）共聚物作为功能基质，甘油单硬脂酸酯（GMS）作为衍生化试剂。得益于SMA共聚物中疏水基团（苯环和长烷基链）和亲水基团（羧基和羟基）的协同作用，制备的固定相表现出独特的混合亲水相互作用色谱/反相液相色谱（HILIC/RPLC）保留机制。该固定相对亲水性和疏水性小分子均表现出优异的分离选择性和稳定性，柱效最高可达81,029 N/m。值得注意的是，这种固定相克服了传统单模式色谱柱的局限性，能够同时分离和分析不同类别、酰基链长度和饱和度不同的磷脂。此外，通过将Sil-SMA-GMS柱与质谱（MS）联用，开发了一种用于血清外泌体磷脂的非靶向分析方法。将该方法应用于乳腺癌患者和健康对照者的血清外泌体后，鉴定了9大类共200种磷脂分子亚型，并筛选出与乳腺癌发病机制密切相关的磷脂标志物。
意义
本研究提出了一种用于复杂生物样本中高效分离磷脂的新型色谱材料，为构建多维脂质组学平台奠定了技术基础。这一进展为癌症相关生物标志物的筛选、肿瘤代谢机制的阐明以及靶向治疗靶点的探索提供了重要支持。
引言
外泌体是由细胞分泌的纳米级囊泡，在“液体活检”应用中起着关键作用。这些外泌体中封装的生物活性分子（包括磷脂、蛋白质和核酸）为了解细胞状态提供了宝贵信息，并在体液中表现出显著的稳定性，从而实现了无创诊断方法[1]，[2]。外泌体的磷脂组成（如磷脂酰胆碱、鞘磷脂和神经酰胺）不仅对维持膜完整性至关重要，还影响外泌体的生物发生、介导细胞摄取和调节信号通路[3]，[4]。最新研究表明，外泌体磷脂谱型会因疾病而发生改变，为诊断和治疗提供了关键线索。在肺癌中，特定的外泌体磷脂特征可以有效区分患者和健康个体，其中鞘磷脂衍生的神经酰胺被确定为影响肿瘤进展的第二信使[3]。在胰腺癌中，外泌体磷脂的改变与肿瘤转移和药物耐药性相关，例如Glypican-1阳性的外泌体可作为潜在的早期诊断标志物[5]。此外，在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，外泌体内的异常磷脂与tau蛋白聚集有关，为早期诊断提供了新的途径[6]。总体而言，这些发现突显了外泌体磷脂谱型在疾病诊断中的重要作用，并为通过液体活检方法推进精准医学奠定了基础。
精确分离和分析外泌体磷脂对于实现其临床诊断潜力至关重要[7]。然而，在实际应用中仍存在一些挑战。磷脂具有相当大的结构异质性，具有多种极性头基（如胆碱、乙醇胺和丝氨酸）和广泛的脂肪酸链（长度从C14到C24，含有0到6个双键）[8]。这种复杂性常常导致常见的色谱问题，如峰重叠、拖尾和共洗脱。使用C18固定相的反相色谱主要基于脂肪酸链的疏水性来分离磷脂，但这种方法对于磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸等极性磷脂的保留效果不佳，导致早洗脱和分辨率降低[9]。亲水相互作用色谱（HILIC）是一种补充方法，可根据极性头基区分磷脂类别，但难以有效分离非极性脂肪酸链，也容易发生共洗脱；例如，在HILIC-ICP-HRMS分析中，磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰丝氨酸（PS）经常共洗脱，而磷脂酸（PA）常常出现峰宽化。尽管优化流动相可以在一定程度上提高分离效果，但调整缓冲液组成和柱温的效果有限[10]。此外，HILIC对流动相pH值敏感，这可能影响固定相的电荷状态和磷脂的离子化，从而影响定量重复性和加合物的形成[11]。鉴于适合脂质分离的色谱固定相较为稀缺，开发新型专用固定相材料对于改善复杂脂质样本的分离和分析至关重要。
近年来，由于苯乙烯-马来酸酐共聚物（SMA）独特的两亲结构[12]，[13]，[14]，在生物膜研究中受到了广泛关注。SMA中的疏水苯乙烯段能够有效插入脂质双层中，促进其溶解并形成“苯乙烯-马来酸酐脂质颗粒”（SMALPs）。这一过程强调了SMA与脂质之间的强相互作用[15]，[16]。可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合技术是一种活性可控的自由基聚合技术，可以在保持窄分子量分布的同时调节SMA共聚物的结构。该技术为开发高性能色谱填料材料提供了有效策略[17]，[18]。研究表明，通过RAFT聚合合成的SMA共聚物可以通过马来酸酐基团的亲核开环反应进一步修饰，生成多种SMA衍生物，如SMA-谷氨酸、SMA-硫醇和SMA-聚乙烯亚胺[19]，[20]，[21]。这些衍生物在提取膜蛋白方面表现出更高的效率、更好的稳定性和选择性[22]，[23]。
在本研究中，通过RAFT聚合技术将SMA共聚物可控地接枝到硅胶表面，构建了共聚物刷状固定相（Sil-SMA）。随后与甘油单硬脂酸酯（GMS）进行酯化反应，成功制备了新型Sil-SMA-GMS色谱固定相。进一步系统评估了该固定相对亲水性和疏水性分子的保留机制和分离性能，并与市售色谱柱进行了比较。在此基础上，进一步验证了Sil-SMA-GMS填料柱对多种磷脂标准物的分离能力。最后，建立了一种结合Sil-SMA-GMS色谱和质谱的分析方法，并应用于乳腺癌患者和健康个体的血清外泌体中磷脂分子的差异鉴定。
试剂和材料
球形多孔硅胶（5 μm，120 ?）购自Daisogel（日本大阪）。商用C18色谱柱（5 μm，120 ?，150 mm × 4.6 mm内径）购自EliteHPLC（中国大连）。无水四氢呋喃（THF）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）购自Innochem（中国北京）。苯乙烯、4-甲基-2-戊酮（MIBK）和（3-甘油氧基丙基）三甲氧基硅烷（GPTMS）购自Alfa Aesar（中国上海）。马来酸酐由Thermo Fisher提供
Sil-SMA-GMS固定相的表征
首先，使用TGA对Sil-SMA-GMS固定相进行了表征。如图2a所示，Sil-GPTMS、Sil-CMDB、Sil-SMA和Sil-SMA-GMS的热降解损失逐渐增加，与SiO2相比。这一观察结果证实了Sil-SMA-GMS固定相的成功制备。进一步使用FT-IR光谱对Sil-SMA-GMS固定相进行了表征。如图2b所示，与硅胶相比，Sil-GPTMS表现出
结论
本研究通过RAFT聚合技术成功合成了新型基于硅的Sil-SMA-GMS共聚物刷状色谱固定相。SMA共聚物作为功能基质，GMS作为衍生化试剂。通过利用SMA共聚物结构中疏水苯环和长链烷基与亲水羧基和羟基之间的协同作用，该固定相建立了独特的混合保留机制
CRediT作者贡献声明
Meijuan Xue：撰写 – 审稿与编辑，验证。Xinhui Guan：验证，数据管理。Ping Wang：撰写 – 初稿，研究，数据管理。Xiaofei Gu：撰写 – 审稿与编辑，形式分析。Xiaoqiang Qiao：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源管理，项目协调，资金获取，概念构思
伦理批准
本研究已获得河北大学附属医院伦理委员会的批准（HDFY-LL-2022-036）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号22274035）和河北大学校长基金（编号XZJJ202308）的财政支持。
