《Analytica Chimica Acta》：Determination of dissociation constants between single-protein and multicomponents by a multi-chamber membrane separation electrophoresis system as a complementary tool
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单靶点多组分相互作用研究新方法：以酪氨酸酶与三种抑制剂为例，采用多室膜膜分离电泳系统（MCMSE）结合直接竞争法，发现传统荧光光谱法（FS）与MCMSE在竞争抑制与非竞争抑制机制解析上存在差异，揭示动力学与构象变化对结合常数的影响。
上海宝|朱宇伟|刘永龙|杨雷|曲彦英|崔美宇|董美华|肖芳帆|李东豪
化学系，国家实验化学教育示范中心，延边大学，吉林省延吉市133002，中国
摘要
背景
长期以来，针对单靶点多组分相互作用的研究一直缺乏有效的方法，主要依赖于解离常数（K_D）的测定和竞争性置换模型。然而，所获得的信息相对有限，无法完全反映体内的结合情况。本研究开发的多腔室膜分离电泳系统（MCMSE）在保持蛋白质天然状态的同时，结合了色谱法对结合组分的定量分析，能够直接通过竞争性方法研究单靶点多组分相互作用，有效补充了基于荧光的测定方法。
结果
以酪氨酸酶（TYR）与曲酸（KA）、富马酸（FA）和芹菜素（API）的多组分相互作用为例进行了研究。对于TYR与KA和FA的系统，MCMSE和荧光光谱（FS）的结果一致。尽管KA与TYR的结合强度略高于FA，但FA表现出对KA的别构竞争效应，降低了KA与TYR的结合。TYR与KA和API结合的系统在两种研究方法下产生了不同的结果。FS仅显示由于API的别构效应导致K_D（TYR-KA）显著增加，而MCMSE则显示TYR-KA和TYR-API的K_D均显著增加。这两组结果表明，别构效应和结合动力学可能共同决定了KA和API的结合亲和力，同时TYR的构象变化也起着重要作用。
意义
在复杂的别构系统中，单一的研究策略可能提供的信息有限，甚至会掩盖结合过程的关键特征。MCMSE作为一种补充工具，用于直接竞争性测定，可以确定单靶点多组分相互作用的K_D（s），为复杂系统提供更多关于结合过程的信息。
引言
众所周知，小分子与生物大分子的相互作用构成了生物协同作用网络的重要组成部分[1][2]。评估小分子-生物大分子的相互作用对于理解许多分子层面的生物过程以及发现临床诊断用的药物候选物和生物标志物至关重要[3][4][5][6]。许多实验技术可用于研究蛋白质-配体结合的各个方面[7][8]，常见的包括等温滴定量热法（ITC）[9][10]、生物层干涉测量法（BLI）[11][12]、表面等离子体共振（SPR）[13][14]和荧光光谱（FS）[16][17]，这些技术可以提供结合常数（K_b）（或解离常数K_D）、动力学结合速率常数（k_on）、解离速率常数（k_off）、结合自由能（ΔG）、结合焓（ΔH）、结合熵（ΔS）、结合热容变化（ΔC_p）以及结合事件的化学计量比（n）等信息。
目前，上述方法大多直接适用于单靶点和单组分相互作用的简单系统。然而，生物体内的功能通常很复杂，多个小分子可能同时与同一蛋白质相互作用，这种相互作用往往不能简单地等于各个相互作用的总和。此外，当蛋白质与小分子结合时，可能发生多种相互作用机制，如竞争性抑制（或非竞争性抑制）[18][19]和别构效应[20][21]。因此，学者们通常采用不同的方法来处理这些复杂情况，主要分为直接竞争性测定和竞争性置换测定。直接竞争性测定涉及预先混合两种或更多已知浓度的小分子，然后让它们与蛋白质相互作用[22][23]，但只有少数分析方法能够满足这一要求，例如毛细管电泳-前端分析（CE-FA）[24][25][26]、天然质谱[1]。竞争性置换测定首先让固定浓度的小分子与蛋白质结合，然后再加入另一种小分子进行竞争性结合[15][27][28][29][30]。然而，由于上述技术的测量原理存在局限性，竞争性置换测定已成为主要的研究模型。因此，实验设计需要组合安排，导致程序繁琐。此外，这种方法引入了组分添加顺序的问题，因为最初添加的小分子可能会占据结合位点，并优先引起构象变化，从而影响其他小分子与目标蛋白质的结合，同时忽略了结合动力学对不同结合效应的影响。如果使用直接竞争性测定，结果只能反映多个分子共同作用后亲和力的累积变化。这些方法无法准确定量分析每个组分与蛋白质的同时相互作用。
多腔室膜分离电泳技术（MCMSE）由李的团队提出[31][32]。该技术结合了腔室设计、电泳和生物亲和力相互作用，可用于筛选中药等复杂系统中的潜在活性成分，并确定K_D（s）。这种非破坏性技术的特点包括低电压（<35 V）、可重复性和灵敏度的平衡、无需固定化、修饰或标记，甚至没有分子量限制。更重要的是，它可以与后续的色谱分离和检测相结合，实现对亲和结合小分子的全面定量分析。在本研究中，使用曲酸（KA）[33]、富马酸（FA）[34]和芹菜素（API）作为模型抑制剂，酪氨酸酶（TYR）作为模型蛋白质，这些分子已被报道为TYR的抑制剂。特别是KA是一种公认的TYR抑制剂，对TYR的单酚酶活性具有竞争性抑制作用，但对二酚酶活性具有混合型抑制作用[36]。本研究采用FS和竞争性置换策略进行比较，并结合直接竞争性方法来确定它们三元系统中的K_D（s）。
试剂和仪器
10 kDa聚醚砜（PES）超滤膜购自SEPRO公司（美国）。0.45 μm亲水性聚四氟乙烯（H-PTFE）微孔膜购自海宁德尔夫新材料技术有限公司（中国海宁）。甲醇（MeOH，色谱级）由Thermo Fisher Scientific公司（美国）提供。氢氧化钠（NaOH）购自上海麦克林生化技术有限公司（中国上海）。盐酸（HCl，分析级）由...
MCMSE的配置和工作流程
在本研究中，MCMSE包括电源、缓冲液循环系统、冷却系统和分离腔室，如图1A所示的自制仪器。分离腔室从左到右分为五个腔室：正电极腔室、正极接收腔室、样品腔室、负极接收腔室和负电极腔室，使用商用PES和H-PTFE膜进行分隔。
结论
总之，本研究尝试使用MCMSE来研究单靶点多组分相互作用分析，主要关注K_D（s）的测定。由于MCMSE与后端色谱分离和分析的结合，该技术能够对多个小分子进行定量分析，从而允许采用直接竞争策略来探索单靶点与多个分子之间的相互作用。
CRediT作者贡献声明
李东豪：撰写、审稿与编辑、监督、资源准备、概念构思。
肖芳帆：方法学设计。
董美华：资源准备。
崔美宇：实验研究。
朱宇伟：方法学设计、实验研究。
上海宝：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计。
刘永龙：方法学设计、实验研究。
曲彦英：方法学设计、实验研究。
杨雷：方法学设计、实验研究。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
数据可用性
数据可应要求提供。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22466035、22376177、22174100）、高等教育学科创新项目（编号：D18012）、吉林省农业食品质量与安全评价重点实验室、吉林省教育厅（编号：JJKH20250401KJ）以及吉林省科学技术厅（编号：YDZJ202301ZYTS301）的财政支持。
