大口黑鲈（Micropterus salmoides）中LEAP2家族成员的抗菌功能及机制的比较分析

《Aquaculture》：Comparative analysis on antibacterial function and mechanism of LEAP2 family members in largemouth bass ( Micropterus salmoides)

抗菌肽LEAP2家族在大型口鲈中的进化保守性、抗菌活性及作用机制差异分析。通过比较MsLEAP2与MsLEAP2L的序列保守性、理化特性及抗菌活性，发现MsLEAP2L具有更广谱稳定的杀菌能力，而MsLEAP2通过破坏细菌膜完整性和DNA结合发挥作用，但生理盐浓度下无直接杀菌活性。体内实验证实两者均能抵抗Aeromonas hydrophila感染，但MsLEAP2组死亡率更高，提示其通过免疫调节机制参与抗菌防御。

　　

张艳琪|向阳溪|李成华

中国宁波大学农产品安全国家重点实验室，宁波315211

摘要

肝脏表达的抗菌肽2（LEAP2）是一种在脊椎动物中具有广谱抗菌活性的保守抗菌蛋白。然而，LEAP2家族成员之间的直接抗菌效力及其在巨口黑鲈（Micropterus salmoides）中的抗菌活性仍不清楚。在本研究中，生物信息学分析显示，与四足动物LEAP2同源物相比，MsLEAP2比其家族成员MsLEAP2 Like（MsLEAP2L）更具保守性。MsLEAP2L表现出广谱和稳定的抗菌活性，而MsLEAP2的抗菌活性有限。MsLEAP2在低渗条件下表现出微弱的杀菌活性，但在正常生理盐浓度下缺乏直接抗菌活性。MsLEAP2和MsLEAP2L都通过破坏细菌膜完整性和结合细菌DNA来发挥杀菌作用。这两种肽都针对细菌表面的PAMPs（LPS、PGN和LTA）以诱导膜损伤。值得注意的是，MsLEAP2L通过靶向LPS、PGN和LTA结合细菌DNA，而MsLEAP2则通过LPS和PGN结合DNA。尽管MsLEAP2在生理盐条件下缺乏抗菌活性，但它像MsLEAP2L一样介导了巨口黑鲈对Aeromonas hydrophila感染的抵抗力。然而，MsLEAP2组的死亡率和组织细菌负荷高于LEAP2L组，这表明MsLEAP2的免疫调节机制可能有助于抗菌免疫防御。总体而言，这些发现突显了LEAP2家族内的功能差异，强调了MsLEAP2和MsLEAP2L作为细菌感染免疫防御治疗剂的潜力。

引言

肝脏表达的抗菌肽（LEAPs）是一类富含半胱氨酸残基的血液来源抗菌肽（AMPs）（Howard等人，2010年）。根据二硫键的数量，它们被分为两种类型：肝脏表达的抗菌肽1（LEAP1）和肝脏表达的抗菌肽2（LEAP2）（Krause等人，2000年；Krause等人，2003年）。LEAP1含有八个保守的半胱氨酸残基，形成稳定的β-折叠结构，而LEAP2含有四个保守的半胱氨酸残基，生成两对二硫键（Wang等人，2024年）。LEAP1后来在人类尿液中被发现，并被重新命名为hepcidin，它是研究最广泛的抗菌蛋白之一（Liang等人，2013年）。相比之下，关于LEAP2的研究相对较少（Liang等人，2013年）。

LEAP2于2003年首次在人类血液超滤液中被发现（Howard等人，2010年；Krause等人，2003年）。由于其在疾病状态下血浆中的含量增加，它被归类为抗菌肽（Francisco等人，2020年；Sakai等人，2021年）。作为第二种从血液中提取的人类抗菌肽，LEAP2在肝脏中合成并以多种剪接变体形式分泌到血液中以对抗病原体（Krause等人，2003年）。LEAP2基因包含三个外显子和两个内含子，其结构特征包括一个信号肽、一个前肽和一个从前体蛋白切割而来的成熟肽（Henriques等人，2010年；Howard等人，2010年；Sosinski等人，2025年）。人类LEAP2的前体蛋白由77个氨基酸残基组成。最初的22个氨基酸（残基1至22）作为信号肽，而残基23至37在翻译后修饰过程中被去除，最终形成成熟的LEAP2肽（残基38至77）（Liu等人，2023年；Sosinski等人，2025年）。早期研究表明LEAP2在抗菌免疫防御中起着关键作用，可清除多种病原体，包括Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Micrococcus luteus和Neisseria cinerea（Henriques等人，2010年；Yu等人，2024年）。最近的研究发现，小鼠（Mus musculus）的LEAP2可作为胃饥饿素受体—生长激素分泌促进受体1a（GHSR1a）的拮抗剂，抑制胃饥饿素-GHSR1a相互作用及随后的生长激素分泌（Cornejo等人，2021年；Ge等人，2018年）。此外，LEAP2还调节成纤维细胞生长因子和活化素信号通路，影响胚胎发育，并在其他物种中调节单核细胞/巨噬细胞（MO/MФ）的极化（Chen等人，2019年；Thiébaud等人，2016年）。这些发现表明LEAP2不仅在免疫防御中起重要作用，还可以作为代谢调节因子，尤其是在胃饥饿素信号通路中。

与哺乳动物类似，LEAP2在软骨鱼类、硬骨鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类中也是保守的（Chen等人，2019年；Chen等人，2023年；Ishige等人，2016年；Liang等人，2013年；Liu等人，2020年；Thiébaud等人，2016年；Wang等人，2024年）。在哺乳动物中保守的-RXXR-切割基序在硬骨鱼类中也得到保留，反映了该区域的进化稳定性（Krause等人，2003年；Zhang等人，2004年）。与哺乳动物只有一个LEAP2同源物不同，大多数硬骨鱼类至少有两种LEAP2异构体，有些物种甚至有三种（Liu等人，2023年；Xu等人，2011年；Yang等人，2014年）。尽管LEAP2是在二十多年前发现的，其哺乳动物中的作用越来越清楚，但由于可用研究模型的限制，硬骨鱼类LEAP2的研究进展相对缓慢。LEAP2被认为是硬骨鱼类先天免疫对抗病原体的关键组成部分，其表达与免疫反应紧密相关，并作为多种免疫因子的调节因子（Liu等人，2010年）。尽管鱼类中的LEAP2异构体多样，但大多数研究表明它们参与了抗菌反应（Sosinski等人，2025年），这表明抗菌活性在进化过程中是保守的。例如，普通鲤鱼（Cyprinus carpio）在感染Vibrio anguillarum后皮肤中的LEAP2表达增加，表明其在硬骨鱼类黏膜屏障防御中可能发挥作用（Yang等人，2014年）。然而，不同鱼类物种之间的LEAP2表达模式存在显著差异。例如，金鲷鱼（Trachinotus ovatus）的LEAP2在肝脏中的表达量最高，在肠道中的表达量最低，而大黄鲷鱼（Larimichthys crocea）的肠道转录水平高于肝脏（Lei等人，2020年；Li等人，2014年）。这些发现强调了LEAP2结构和功能的进化保守性以及物种特异性适应性。

先前的研究表明LEAP2在抗菌免疫防御中起作用（Chen等人，2019年；Wang等人，2024年；Zhu等人，2025a），然而，对其家族成员之间抗菌活性的比较研究仍然很少。作为全球重要的淡水养殖物种，LEAP2家族成员在巨口黑鲈（Micropterus salmoides）中的抗菌活性尚不清楚。因此，在本研究中，我们使用巨口黑鲈作为模型，对其两种LEAP2家族成员LEAP2和LEAP2 Like（LEAP2L）的抗菌活性和机制进行了比较分析，以阐明它们在先天免疫防御中的功能差异。我们首先对LEAP2和LEAP2L在脊椎动物物种中的保守性进行了分析，以研究它们的进化保留情况。随后进行了全面的结构、电荷分布和疏水性分析，以阐明它们的理化性质。基于这些基础分析，我们进一步比较了它们的抗菌活性、杀菌动力学和作用机制。最后，我们在体内验证了它们的抗菌效果，并评估了它们对Aeromonas hydrophila感染的保护作用，从而将体外的研究结果与生理相关性联系起来。结果揭示了早期脊椎动物LEAP2在抗菌免疫中的进化保守特征。

章节片段

伦理声明

实验所用的大口黑鲈重量为20±5克，来自中国湖州灵湖养殖基地。所有实验均严格遵循宁波大学实验动物中心的指导方针进行。实验方案得到了宁波大学动物研究伦理委员会的批准。在整个研究过程中，我们尽一切努力减少动物痛苦。

序列、蛋白质结构域、染色体定位和系统发育分析

本研究中使用的所有cDNA和氨基酸序列均从NCBI下载（

巨口黑鲈中存在进化保守的LEAP2

序列比对分析显示，巨口黑鲈的LEAP2和LEAP2L与其他脊椎动物的LEAP2同源物具有显著的序列同源性，并在其各自的进化亚组中紧密聚集（图1A）。所有物种的LEAP2都具有三个保守的结构域，包括一个信号肽、一个前肽和一个成熟肽（图1A）。巨口黑鲈LEAP2的初级结构在进化上是保守的，特别是在成熟肽结构域中（图1A和

讨论

抗菌肽（AMPs）通常是由12-50个氨基酸组成的小分子蛋白质，富含阳离子氨基酸和疏水残基，形成两亲结构（Brogden，2005年；Zasloff，2002年）。它们可以消灭革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒，还可以抑制寄生虫和肿瘤细胞（Brogden，2005年；Zasloff，2002年）。此外，AMPs还可以激活T细胞和中性粒细胞，促进伤口愈合，并调节炎症反应（Adnan

合规性和伦理

作者没有财务利益冲突。

CRediT作者贡献声明

张艳琪：撰写——原始草稿，项目管理，方法学，研究设计，资金获取，概念构思。向阳溪：可视化，验证，软件使用，资源提供。李成华：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，监督，项目管理，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32503232, 32325050）的支持。