《BioChip Journal》：Screening of Anti-Erythropoietin Antibody from Autodisplayed Combinatorial Twin-Chain Fv Libraries
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细菌表面展示技术通过双链Fv文库实现VH/VL链共表达，结合氧化还原重折叠（GSH/GSSG 10:1）和CDR3随机突变策略，显著提升抗EPO抗体亲和力（从49.2 nM升至5.6 nM）。该大肠杆菌表面展示系统实现功能偶联与高效筛选，为抗体开发提供新平台。
摘要
细菌表面展示（Autodisplay）技术能够高效筛选抗体片段，但传统的噬菌体展示方法无法分别表达可变重链（VH）和轻链（VL），这限制了组合多样性和基于亲和力的直接筛选。本研究旨在开发一种组合型双链Fv（tcFv）文库，以实现VH和VL链在大肠杆菌表面的共展示，并通过结构重折叠来增强结合亲和力。这些Fv片段来源于人类抗甲状腺过氧化物酶抗体，利用Autodisplay系统独立表达。通过随机化两条链的CDR3区域构建了组合文库（遗传多样性：1.52×10? cfu）。筛选过程采用Alexa 488标记的促红细胞生成素（EPO）进行，通过流式细胞术和荧光激活细胞分选技术完成。通过Alexa 488标记的VH与Alexa 546标记的VL之间的荧光共振能量转移（FRET）验证了tcFv的形成。利用含有还原型与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG，比例为10:1）的氧化-重排试剂优化了重折叠过程。一种名为tcFv.K18.23的变体对EPO表现出较高的亲和力（KD = 49.2 nM，n = 3）。FRET结果显示VH.K18和VL.23在小于10纳米的距离内成功组装。将VH与VL的混合比例优化至44%:56%后，结合活性达到最大值（n = 3，p < 0.05）。正如预期的那样，重折叠进一步将亲和力提高了约九倍（KD = 5.6 nM，n = 3）。所开发的组合型Fv（tcFv）文库实现了VH和VL链在大肠杆菌上的功能共展示和重折叠，从而能够快速筛选出高亲和力的抗体片段。该系统为抗体发现和工程化提供了一个简单且经济高效的平台。
细菌表面展示（Autodisplay）技术能够高效筛选抗体片段，但传统的噬菌体展示方法无法分别表达可变重链（VH）和轻链（VL），这限制了组合多样性和基于亲和力的直接筛选。本研究旨在开发一种组合型双链Fv（tcFv）文库，以实现VH和VL链在大肠杆菌表面的共展示，并通过结构重折叠来增强结合亲和力。这些Fv片段来源于人类抗甲状腺过氧化物酶抗体，利用Autodisplay系统独立表达。通过随机化两条链的CDR3区域构建了组合文库（遗传多样性：1.52×10? cfu）。筛选过程采用Alexa 488标记的促红细胞生成素（EPO）进行，通过流式细胞术和荧光激活细胞分选技术完成。通过Alexa 488标记的VH与Alexa 546标记的VL之间的荧光共振能量转移（FRET）验证了tcFv的形成。利用含有还原型与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG，比例为10:1）的氧化-重排试剂优化了重折叠过程。一种名为tcFv.K18.23的变体对EPO表现出较高的亲和力（KD = 49.2 nM，n = 3）。FRET结果显示VH.K18和VL.23在小于10纳米的距离内成功组装。将VH与VL的混合比例优化至44%:56%后，结合活性达到最大值（n = 3，p < 0.05）。正如预期的那样，重折叠进一步将亲和力提高了约九倍（KD = 5.6 nM，n = 3）。所开发的组合型Fv（tcFv）文库实现了VH和VL链在大肠杆菌上的功能共展示和重折叠，从而能够快速筛选出高亲和力的抗体片段。该系统为抗体发现和工程化提供了一个简单且经济高效的平台。
