《Biomaterials》：A self-assembled fluorescent contrast agent for imaging-guided simultaneous resection of breast tumors and metastatic lymph nodes in surgery
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精准肿瘤定位与淋巴结转移检测；近红外荧光探针；XIAP靶向；术中导航；乳腺癌手术优化
马晓青|王丽英|张玉星|张妮媛|李浩泽|梁建晓|廖玉西|安宏伟|张希良|王浩
中国科学院纳米科学卓越创新中心，纳米材料与纳米安全生物医学效应国家重点实验室，国家纳米科学和技术中心（NCNST），中国北京市海淀区中关村北一條11號，100190
摘要
在乳腺癌手术中，精确的术中边缘评估和可靠的转移性前哨淋巴结（SLN）检测仍然是一个关键挑战。我们开发了sa-FCA，这是一种新型的XIAP靶向近红外荧光探针，通过肿瘤选择性级联激活和原位自组装纳米结构，实现了更高的肿瘤特异性和灵敏度，以及更长的成像时间。在乳腺癌的小鼠模型中，sa-FCA表现出精确的肿瘤定位、对转移性SLN的敏感检测以及自发肺转移的识别。使用人类样本的临床评估显示，它在区分肿瘤和良性组织（如纤维腺瘤）方面表现出色（n = 252名患者，灵敏度为99.59%，特异性为97.37%），并且能够清晰地勾勒出病变边界。此外，它还能准确区分转移性和非转移性SLN，灵敏度为98.18%，特异性为92.31%（n = 69）。通过显著提高转移性SLN的检测能力，sa-FCA克服了传统病理学中的术中诊断延迟问题，促进了即时手术决策。sa-FCA能够精确靶向肿瘤、区分纤维腺瘤并识别转移性淋巴结，从而实现肿瘤的完全切除并最大限度地保留正常组织，从而提高了肿瘤学安全性和美容效果。这些发现为图像引导的乳腺癌手术树立了新的范例，并推动了荧光引导干预措施的临床转化。
引言
保乳手术（BCS）和腋窝前哨淋巴结（SLN）活检是适合的早期乳腺癌患者的标准治疗选择[1]，[2]。尽管这些是标准化程序，但在临床实践中仍存在重大挑战。外科医生面临着在术中准确评估手术边缘和SLN的关键任务，依赖冷冻切片分析来指导手术决策并防止二次手术[3]，[4]。特别是，冷冻切片分析容易遗漏手术边缘的原位病变和淋巴结微转移（定义为显微镜下病变>0.2毫米但≤2毫米）[5]，这突显了改进术中检测方法的迫切需求。Esbona报告称，冷冻切片病理学在边缘评估后的重新切除率为10%[6]，而Cendán发现冷冻切片病理学对SLN的灵敏度低至23.5%[7]。此外，冷冻切片病理学对肿瘤边缘和SLN的检测需要0.5小时到1小时[8]。阳性边缘的存在或阳性SLN活检的需要会进一步延长手术时间，给患者带来麻醉和手术部位感染的风险[9]，并降低手术团队的整体效率。
因此，迫切需要一种能够实时准确评估手术边缘和淋巴结转移的集成技术，以改善术中决策[10]。通过向外科医生提供关于肿瘤边界和淋巴结受累的实时信息[11]，这种方法将优化手术流程，缩短手术时间，并可能避免二次手术[12]。近年来，荧光分子成像（FMI）作为一种强大的实时可视化工具出现，实现了动态评估[13]，[14]，并成为乳腺癌手术中的创新引导技术[15]，[16]。通过开发新型靶向探针[17]，[18]以及对肿瘤微环境特征（如酶活性[19]，[20]、谷胱甘肽[21]、代谢酸度[22]）有反应的纳米探针，乳腺癌成像取得了显著进展。然而，对于肿瘤边缘和淋巴结转移（尤其是微转移）的残留显微病变的高灵敏度成像仍存在重大挑战[23]，[24]。尽管像EndoSCell?手持显微镜这样的术中成像设备可以实现亚细胞分辨率，但由于传统荧光团（如ICG）的低量子效率和较差的光稳定性，亚毫米病变的检测仍然受到限制，导致灵敏度不足[25]，[26]，[27]。
基于我们团队建立的体内自组装平台，我们成功设计并合成了sa-FCA，这是一种基于肽的泛癌靶向荧光对比剂，由特定的酶可切割肽序列与高性能荧光团结合而成（图S1）[28]。当sa-FCA识别到XIAP并在肿瘤细胞内激活caspase-3时，会触发自组装过程，导致原位形成肽纳米纤维[29]。这种肽纳米纤维结构通过有序堆叠肽残基，在荧光基团之间保持大于5 ?的空间距离，从而避免荧光淬灭，并在FBS中实现高达21%的高荧光量子产率[30]。此外，组装结构的空间限制增强了荧光基团的光稳定性，抑制了非辐射性内部转化、异构化和降解[28]。在这项研究中，我们评估了这种高光稳定性的自组装荧光剂在BCS和转移性淋巴结（特别是微转移）术中高灵敏度成像方面的能力，从而证明了其在临床转化中的巨大价值，并突显了其在推进图像引导手术肿瘤学方面的巨大潜力。
部分片段
细胞培养
本研究中使用的细胞系包括小鼠乳腺癌细胞（4T1、4T1-Luc）、人类乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-231-Luc、MCF-7、HCC-1954）和正常乳腺上皮细胞（MCF-10A），均购自Cellverse有限公司。
细胞活力检测
使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒检测细胞活力。将MCF-10A细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种在96孔板中，并在专用于MCF-10A细胞的完全生长培养基中培养过夜。
sa-FCA对乳腺肿瘤细胞的特异性
荧光剂的成像特异性对于图像引导手术应用至关重要。为了评估sa-FCA对乳腺癌细胞的特异性，我们研究了其与几种乳腺癌细胞系（MCF-7、HCC-1954、MDA-MB-231）以及正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）的相互作用。由于ICG广泛用作肿瘤成像的荧光探针，因此在本研究中作为理想的对照。Western blot（WB）分析显示...
结论
在这项研究中，我们评估了一种基于体内自组装生物技术的泛癌靶向肽荧光对比剂的性能，该对比剂可用于高灵敏度成像，以检测BCS手术边缘和淋巴结转移（特别是淋巴结中的微转移），及其在临床转化中的应用。该对比剂通过原位自组装放大效应的双重增强机制显著提高了成像灵敏度...
CRediT作者贡献声明
王丽英：撰写——原始草稿，项目管理，数据管理，概念构思。张玉星：撰写——原始草稿，项目管理，数据管理，概念构思。张妮媛：撰写——原始草稿，项目管理，数据管理，概念构思。李浩泽：撰写——审稿与编辑，验证，监督，资金获取。王浩：撰写——审稿与编辑，验证，监督，资金获取。马晓青：撰写——原始草稿
数据可用性声明
支持本研究的数据可在文章和补充信息中找到，或根据要求向作者索取。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（52322308、52273126）、国家重点研发计划（2022YFA1205700）和北京Nova计划（20240484673、20230484237）的支持。
