一种新型近红外COX-2靶向探针，用于肿瘤和转移淋巴结的监测

《Bioorganic Chemistry》：A novel near-infrared COX-2 targeting probe for tumor and metastatic lymph node monitoring

靶向COX-2的近红外荧光探针NY-IND在术中实现高特异性肿瘤及转移灶定位，解决传统方法灵敏度低的问题。

　　

作者：敖宇、李云龙、王一梅、何健、周勇、蔡慧明、王一青、戴波、沈毅

南京中医药大学金陵临床医学院，中国南京

摘要

术中荧光引导成像已经改变了肿瘤外科手术，但目前临床批准的探针对原发肿瘤和转移性淋巴结缺乏特异性。本文我们开发了一种近红外荧光（NIRF）探针NY-IND，该探针针对环氧化酶-2（COX-2）。NY-IND不仅具有高水溶性，还具有较高的荧光量子产率和优异的生物安全性。NY-IND对COX-2靶点的结合亲和力很高，解离常数（Kd）为99.69 nM，因此能够特异性识别COX-2过度表达的肿瘤细胞和组织。注射后48小时仍能观察到显著的肿瘤与背景比值（TBR > 6），从而可以清晰区分皮下肿瘤与周围组织。此外，NY-IND在体内代谢过程中肿瘤滞留时间较长（>72小时），为荧光引导下的肿瘤手术提供了更长的成像窗口。NY-IND在检测转移性肿瘤病变（包括肺癌的腹膜转移和淋巴结转移）方面表现出显著的优势。这项工作为实时术中可视化肿瘤和转移灶提供了有前景的工具，提高了手术精度并改善了患者预后。

引言

根治性肿瘤切除是降低复发风险和改善患者长期预后的关键步骤[1]、[2]。然而，在临床手术中，准确识别原发肿瘤边缘、隐匿的微转移灶和区域转移性淋巴结仍然是一个亟待解决的瓶颈[3]、[4]、[5]。对于肺癌和乳腺癌等实体瘤，大约20%–30%的治疗失败是由于术中未能切除微转移灶（< 2 mm）或转移性淋巴结[6]、[7]。根本原因在于传统诊断和治疗方法的局限性：术前成像技术（如CT和MRI）的空间分辨率不足以定位微小病变[8]；术中肉眼检查和数字触诊无法有效区分肿瘤组织和正常组织[9]、[10]。尽管术中冷冻病理学是“金标准”，但其检测时间较长且依赖性强，无法满足实时导航的需求[11]、[12]。因此，开发具有高特异性、高灵敏度和实时性能的术中成像技术对于优化肿瘤手术策略和提高诊断与治疗水平具有重大临床意义[13]、[14]。 近红外荧光（NIRF）技术因其深度组织穿透能力（5–10 mm，波长范围700至900 nm）、低自荧光干扰和高信噪比等优点，成为实时术中成像的最佳技术选择[15]、[16]。与传统荧光染料相比，NIRF探针可以通过专用成像设备实时捕获信号。与术中冷冻病理学相比，NIRF探针对微转移灶（直径0.5–1 mm）和孤立肿瘤细胞的检测率提高了40%以上[17]、[18]、[19]。然而，临床上最常用的荧光探针吲哚菁绿（ICG）缺乏肿瘤特异性，由于增强渗透性和滞留效应（EPR），会在肿瘤中积聚，使得在没有血管供应优势的情况下难以准确识别微转移灶[20]。同时，ICG的药代动力学受到组织微结构差异以及其他患者生化指标（如肝功能[21]）的影响。因此，仍迫切需要能够特异性靶向转移性肿瘤细胞的荧光探针，以识别转移灶和转移性淋巴结。靶向FGSP探针由与靶向基团（如小分子、肽、抗体）结合的探针组成，这些基团旨在靶向肿瘤过度表达的标志物[22]，例如表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子受体（VEGFR）、癌胚抗原（CEA）、整合素、胃泌素释放肽受体（GRPR）、c-Met、人表皮生长因子受体2（HER2）和叶酸受体α（FRα）[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。OTL-38是唯一获得FDA批准的肿瘤特异性靶向探针，它可以通过识别肿瘤细胞表面的叶酸受体，在手术中实现卵巢癌和肺癌的实时定位[29]、[30]、[31]。尽管OTL-38的临床效果较好，但其对叶酸受体α（FRα）和叶酸受体β（FRβ）的相似结合亲和力常常导致炎症组织和淋巴结中出现假阳性信号[32]、[33]、[34]。 肿瘤的淋巴结转移和远处转移与肿瘤细胞对微环境的重塑密切相关[35]、[36]。环氧化酶-2（COX-2）作为调控这一过程的关键分子，是靶向成像的理想靶点。COX-2在正常组织中表达较弱或不存在，但在各种实体瘤（如肺癌、胃癌和乳腺癌）的原发灶中的表达水平比在正常组织中高5–10倍。值得注意的是，这种高表达特征在转移灶和转移性淋巴结中仍然存在[37]、[38]、[39]、[40]。先前的研究证实，乳腺癌腋窝转移性淋巴结中COX-2的阳性率高达82%，而在炎症性淋巴结中仅为15%。这种表达差异源于肿瘤细胞中COX-2介导的前列腺素E2（PGE2）的分泌，这种物质构建了一个免疫抑制性微环境，有利于肿瘤的定植[41]、[42]。同时，COX-2在肿瘤细胞膜表面以稳定的空间构象定位，为小分子探针的特异性结合提供了结构基础。这些特性使其成为区分肿瘤组织与正常组织以及转移灶与良性病变的理想分子标志物[43]、[44]。 基于此，本研究创新地将COX-2的肿瘤特异性表达特征与NIRF的技术优势相结合，设计并构建了一种针对COX-2的NIRF造影剂。利用成熟的COX-2小分子抑制剂吲哚美辛的靶向结合结构，将NIRF基团与靶向配体结合，实现原发肿瘤、转移灶和转移性淋巴结的特异性靶向和实时成像。本研究旨在解决术中转移灶识别中的“准确性”和“实时性能”问题，为根治性肿瘤切除提供视觉导航工具，最终降低术后复发率，从而改善患者的临床预后。

材料与通用仪器

实验中使用的ICG由南京诺源医疗有限公司（中国南京）生产。所有用于有机合成的原材料和溶剂均从Aladdin购买。DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素/胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、磷酸盐缓冲液（PBS）、4%戊二醛、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）均从江苏凯健生物科技有限公司（中国南京）购买。

合理分子结构设计

目前最广泛使用的近红外荧光探针ICG由于其缺乏肿瘤特异性和较低的荧光量子产率，限制了其在荧光引导肿瘤手术中的应用[45]、[46]。如图所示，我们选择吲哚美辛作为COX-2的靶向基团，以提高荧光探针的肿瘤特异性。NY-IND分子可以在血管中循环，并特异性识别肿瘤细胞膜表面的COX-2蛋白。

结论

总结来说，我们合理设计并合成了一种名为NY-IND的COX-2特异性靶向荧光探针。该探针具有COX-2阳性肿瘤特异性、增强的近红外荧光强度、良好的水溶性和优异的生物相容性。NY-IND对COX-2蛋白的Kd值为99.69 nM，能够选择性识别COX-2阳性细胞系，从而实现单细胞成像。它可以在短时间内快速成像，并提供较长的成像时间。

支持信息

支持信息可在线获取。支持材料按提交原样发布，未经排版或编辑。科学准确性和内容的责任完全由作者承担。

企业关系

蔡慧明是南京诺源医疗设备的CEO和股东。本研究得到了南京中医药大学中医药研究所项目、南京鼓楼医院健康教育与研究基金会（ICMN2024019）的支持。本研究还得到了中国国家科学技术委员会（项目编号2016YFC0104100）和国家自然科学基金（项目编号82127806）的资助。

专利背景

与本研究中描述的荧光探针NY-IND的设计和应用相关的专利申请已向中华人民共和国国家知识产权局提交（专利申请编号：202411435274.3；标题：“一种靶向近红外荧光化合物及其制备方法和应用”）。该专利由李云龙共同拥有，目前没有许可协议或商业化的计划。

CRediT作者贡献声明

敖宇：撰写——原始草案、数据整理。 李云龙：撰写——原始草案、研究。 王一梅：数据整理。 何健：研究。 周勇：研究。 蔡慧明：资金筹集。 王一青：监督、资金筹集、概念构思。 戴波：撰写——审阅与编辑、监督。 沈毅：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草案、监督、资金筹集、概念构思。

资助

本研究得到了南京中医药大学中医药研究所项目、南京鼓楼医院健康教育与研究基金会（ICMN2024019）的资助。本研究还得到了中国国家科学技术委员会（项目编号2016YFC0104100）和国家自然科学基金（项目编号82127806）的资助。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：蔡慧明是南京诺源医疗设备的CEO和股东。

致谢

Y.W.感谢“江苏省特聘教授”称号。